[发明专利]基于转录组测序开发的云锦杜鹃SSR引物对及筛选方法与应用

说明书

本发明公开了基于转录组测序开发的云锦杜鹃SSR引物对及筛选方法与应用。属于生物技术领域。该引物是基于转录组测序和序列分析得到，在转录组测序的基础上，对大量数据进行筛选，获取富含SSR位点的unigene序列并进行SSR标记的引物设计，克服了目前云锦杜鹃SSR分子标记数量少、开发效率低的障碍。利用云锦杜鹃群体验证SSR引物的有效性，为云锦杜鹃遗传多样性研究、遗传连锁图谱构、QTL定位、分子标记辅助育种等遗传学研究奠定了基础。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及基于转录组测序开发的云锦杜鹃SSR引物对及筛选方法与应用。

背景技术

云锦杜鹃(Rhododendron fortunei Lindl.)是一种主要生长在海拔600-2000m的常绿灌木或小乔木，中国特有的杜鹃属物种，云锦杜鹃是常绿杜鹃亚属的代表种和杜鹃属植物种间杂种的重要祖先亲本，山顶生态功能重要的维持者，在我国陕西、湖南、浙江、湖北、江西、广西、贵州、云南、福建等省份均有分布，花朵有香味，且抗性较强，具有较高的观赏价值和经济价值。关于云锦杜鹃的研究报道主要集中于区域性云锦杜鹃植物形态学特征、资源分布、资源评价、扦插繁殖技术、离体快繁技术、引种栽培等。云锦杜鹃SSR分子标记的开发可为云锦杜鹃种质资源评价、杂交育种、杜鹃花属植物亲缘关系、群体结构等分析提供参考。

简单重复序列(Simple sequence repeats,SSR)是指2-6个核苷酸基本单位重复多次的DNA序列，广泛分布在真核生物基因组、多态信息量高，共显性遗传、重复性好、特异性强，广泛应用于植物品种纯度鉴定、分子标记辅助育种、遗传图谱构建、功能基因定位、遗传多样性分析等研究中。SSR分子标记可分为基因组SSR(genomic-SSR)和转录组SSR(EST-SSR)，genomic-SSR的开发需要经过基因组文库构建、探针杂交、测序等步骤，成本高且效率低，在非模式植物中难以大规模开展。目前，基于转录组数据开发的EST-SSR标记在豇豆、芝麻等多个植物内报道。此外，由于杜鹃花的基因组尚未测序或者测序数据尚未公布，而其同源物种基因组开发的SSR尚无确定是否能与其通用，所以从转录组上获取SSR分子标记更加经济、可靠，且常与功能基因连锁，在分子标记辅助育种中具有较高的应用价值。

第二代高通量测序技术的发展与成熟使得通过转录组测序高通量获取EST-SSR标记成为了可能。目前，云锦杜鹃多态性SSR标记的报道比较少，极大地限制了其在遗传学研究中的应用。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供基于转录组测序开发的云锦杜鹃SSR引物对及筛选方法与应用。本发明利用RNA-seq技术对云锦杜鹃新鲜花瓣材料进行转录组测序，将数据组装拼接后挖掘含有SSR标记的序列，并将符合SSR引物设计要求的unigenes进行SSR标记的开发，并随机合成部分SSR引物，进行适用性验证。该引物的开发为云锦杜鹃的遗传多样性和遗传结构研究、遗传图谱构建、分子标记辅助育种、重要性状基因定位和克隆等研究奠定基础。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，提供一种基于转录组测序开发的云锦杜鹃EST-SSR引物对，在检测过程中使用25对引物，所述引物分别为：

表1多态性SSR引物信息

第二方面，提供上述云锦杜鹃EST-SSR引物对的下述A1-A6中的任一种用途：

A1、所述EST-SSR引物对在构建云锦杜鹃遗传图谱中的应用；

A2、所述EST-SSR引物对在云锦杜鹃种质鉴定中的应用；

A3、所述EST-SSR引物对在云锦杜鹃育种中的应用；

A4、所述EST-SSR引物对在云锦杜鹃遗传多样性分析中的应用；

A5、所述EST-SSR引物对在云锦杜鹃亲缘关系分析中的应用；