[发明专利]EGFR基因缺失突变检测用组合物、试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种EGFR基因缺失突变检测用组合物，其特征在于：该组合物包括突变型检测用组合物和/或野生型检测用组合物；

所述突变型检测用组合物包括上游引物F1、上游引物F1-1、水解探针P1和下游引物；

所述野生型检测用组合物包括上游引物F2、上游引物F2-1、水解探针P2和下游引物组成；

其中，

所述上游引物F1从5’端至3’端依次由下述两部分组成：

(1)不匹配区：与突变型和野生型的序列均不发生互补配对；该不匹配区的序列从5’端至3’端包括与上游引物F1-1相同的序列，和与水解探针P1相同的序列；

(2)匹配区：仅与突变型的突变位点上下游序列连续互补配对；

所述上游引物F2从5’端至3’端依次由下述两部分组成：

(1)不匹配区：与突变型和野生型的序列均不发生互补配对，该不匹配区的序列从5’端至3’端包括与上游引物F2-1相同的序列，和与水解探针P2相同的序列；

(2)匹配区：仅与野生型的突变位点及其上下游序列连续互补配对。

2.根据权利要求1所述的EGFR基因缺失突变检测用组合物，其特征在于：所述突变型检测用组合物和野生型检测用组合物中的下游引物相同。

3.根据权利要求1或2所述的EGFR基因缺失突变检测用组合物，其特征在于：所述水解探针P1的5’端和3’端上分别修饰报告基团和淬灭基团；所述水解探针P2的5’端和3’端上分别修饰报告基团和淬灭基团；优选地，水解探针P1和水解探针P2上的报告基团分别释放不同的检测信号。

4.根据权利要求1～3任意一项所述的EGFR基因缺失突变检测用组合物，其特征在于：所述上游引物F1的3’端第2～9个碱基处添加1～20个错配碱基；所述上游引物F2的3’端第2～9个碱基处添加1～20个错配碱基。

5.根据权利要求1～4任意一项所述的EGFR基因缺失突变检测用组合物，其特征在于：所述上游引物F1的Tm值高于上游引物F1-1的Tm值；所述上游引物F2的Tm值高于上游引物F2-1的Tm值。

6.根据权利要求5所述的EGFR基因缺失突变检测用组合物，其特征在于：所述上游引物F1的Tm值比所述上游引物F1-1的Tm值高5～20℃，所述上游引物F2的Tm值比所述上游引物F2-1的Tm值高5～20℃。

7.根据权利要求1～6任意一项所述的EGFR基因缺失突变检测用组合物，其特征在于：所述下游引物与靶核酸序列互补配对的位置设置在待检测区域的下游20～100bp处。

8.一种EGFR基因缺失突变检测用试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括权利要求1～7任意一项所述的突变型检测用组合物和/或野生型检测用组合物。

9.一种利用权利要求1～7任意一项所述的组合物进行EGFR基因缺失突变检测的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

首先，将待测样品进行极限稀释并随机分配至10000～20000个反应单元中；

随后，对所有反应单元进行统一的热循环扩增；在热循环扩增的前1～10个循环里，以上游引物F1或上游引物F2和下游引物作为引物对进行靶核酸序列的预扩增；接着，在热循环扩增的后10～50个循环里，以上游引物F1-1或上游引物F2-1和下游引物作为引物对进行预扩增产物的扩增；在热循环扩增的后10～50个循环中，结合在预扩增产物上的水解探针被水解并释放报告基团上的信号；

最后，检测报告基团的信号，根据检测结果判断对应靶核酸序列。

10.根据权利要求9所述的利用权利要求1～7任意一项所述的组合物进行EGFR基因缺失突变检测的方法，其特征在于：所述上游引物F1或上游引物F2的退火温度比上游引物F1-1或上游引物F2-1退火温度高。