[发明专利]一种内肽酶活力测定的新方法

说明书

本发明涉及一种内肽酶活力测定的新方法；是以牛血清白蛋白为底物，根据内肽酶特征产物肽的显色反应，测定反应前后反应体系吸光度值，同时用能反应体系中肽含量多少的标准物绘制标准曲线，通过查标准曲线确定反应前后产物肽含量的变化，从而对内肽酶准确定量。本发明克服了常规内肽酶活力测定过程中蛋白质以及氨基酸的干扰，能快速准确测定内肽酶活力,操作简单，快速。

技术领域

本发明涉及一种内肽酶活力测定的新方法，目的在于准确测定内肽酶活性大小，以提高相关食品加工原料及加工过程、食品用酶等的内肽酶监控准确度，属于食品加工技术领域。

背景技术

内肽酶是蛋白酶的一种，主要作用于蛋白质多肽链内部的肽键使蛋白质长链分解成短肽片段。在许多食品加工原料及食品加工过程中，内肽酶活力的大小直接影响到底物蛋白、产物蛋白的含量及组成比例。比如啤酒酿造原料—麦芽，内肽酶活力的大小关系到成品麦芽库尔巴哈值的大小以及高中低分子的蛋白质含量，进而影响到啤酒泡沫性质以及啤酒的稳定性。内肽酶是很多发酵食品的重要监测指标，但是目前所采用的内肽酶活性测定的方法都不够精确。目前常用的内切酶活力测定方法从原理上分为两种：一种是以牛血红蛋白为底物，适当条件下酶和底物反应，三氯乙酸沉淀蛋白终止反应，在280nm下测定吸光度值，空白管为酶反应前加三氯乙酸终止反应，用反应组和对照组的吸光度值差表示酶活力。在280nm下部分氨基酸以及核酸等生物大分子也存在吸收峰，这种方法测得的是内肽酶和外肽酶的综合酶活力；另一种是内肽酶与蛋白底物反应，沉淀蛋白后，让体系中产物氨基酸与茚三酮反应，测定吸光度值的变化，来表示内肽酶活力，这种方法实际上主要测定的是外肽酶的活力。目前以上两种内肽酶活力测定方法都不能准确反映内肽酶的活力。

发明内容

为了克服现有内肽酶活力测定方法的不足，本发明提供了一种内肽酶活力测定的新方法；本发明通过测定反应体系中内肽酶产物肽含量的增加量来测定内肽酶活力，能准确反映内肽酶活力，而且本发明操作简单，快速。

本发明的原理是：

双缩脲和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络合物，该紫色络合物在540nm下有最大吸收，这种反应叫双缩脲反应。内肽酶反应产物中的寡肽和多肽分子中含有肽键—CO—NH—与双缩脲结构相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定条件下，其颜色深浅与肽含量成正比，可用分光光度计(540nm)来测其吸光度。以双缩脲为标准品，建立双缩脲浓度与540nm下吸光度之间的关系方程，用三氯乙酸沉淀反应体系中的蛋白质，剩余内肽酶反应产物肽，按照标准曲线的方法测定反应体系的吸光度值，将反应体系吸光度值代入标准方程，获得反应体系吸光度值对应的双缩脲的浓度。酶活力单位定义为，固体样品：每克绝干原料每min产生1微克双缩脲为一个酶活力单位；液体样品：每毫升样品溶液每min产生1微克双缩脲为一个酶活力单位。

一种内肽酶活力测定的新方法，步骤如下：

1、标准曲线的绘制

以缩二脲浓度(mg/mL)为横坐标x，吸光度OD值为纵坐标y，绘制标准曲线方程：y＝ax+b(r²≥0.99)，变形得方程-1：x＝(y-b)/a；方程中a，b为常数，分别代表曲线与x轴和y轴的交点。

2、粗酶液提取

对于固体样品，先粉碎过80目筛；参照食品安全国家标准GB5009.3-2016食品中水分的测定，计算固体样品粉末的水分含量，记为w(单位％)；取粉碎后的待测固体样品适量，记为m(单位g)，加入样品质量4倍的pH5.2、浓度为0.1mol/L的柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液，4℃条件下磁力搅拌30min，用pH5.2，浓度为0.1mol/L柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液定容至V(单位mL，根据原料酶活力大小来调整定容体积，酶活力大可以适当增大定容体积，使实验组与对照组540nm下的吸光度差值至少为0.1)4℃条件下过滤收集上清液作为待测粗酶液。