[发明专利]一种利用荧光素霉快速检测生物毒性的方法在审
| 申请号： | 201811574739.8 | 申请日： | 2018-12-21 |
| 公开（公告）号： | CN109971824A | 公开（公告）日： | 2019-07-05 |
| 发明（设计）人： | 马瑶;孙黎;马力 | 申请（专利权）人： | 安徽汇泽通环境技术有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/66 | 分类号： | C12Q1/66 |
| 代理公司： | 上海精晟知识产权代理有限公司 31253 | 代理人： | 冯子玲 |
| 地址： | 230000 安徽省合*** | 国省代码： | 安徽;34 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 虫荧光素酶 急性毒性 快速检测 生物毒性 荧光素 构建 制备 野生型荧光素酶 表达重组质粒 环境监测技术 环境监测领域 基因工程菌 生物测试法 定点突变 毒性测试 发光能力 耐酸碱性 热稳定性 突变位点 直接测试 重组质粒 突变 灵敏 污染物 克隆 引入 环保 应用 | ||
1.一种利用荧光素霉快速检测生物毒性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：将突变位点引入到luc基因；根据荧光素酶编码基因luc设计两组引物，按照overlap PCR程序扩增获得luc两端的序列，拼接片断获得突变基因片段；
步骤二：构建克隆重组质粒；将突变基因与克隆载体相连后进行鉴定，获得克隆重组质粒；
步骤三：获得定点突变的PCR产物；将构建的重组质粒电转到DH5α感受态细胞中进行培养，通过验证、回收得到纯化后的PCR产物；
步骤四：构建表达重组质粒；提取纯化后的PCR产物的重组质粒，经酶切后与表达载体相连得到表达重组质粒；
步骤五：制备表达虫荧光素酶的基因工程菌；将表达重组质粒电转到DH5α感受态细胞中进行培养，筛选鉴定出阳性重组子，并提取重组质粒转入到受体菌株BL21(DE3)中，得到可大量表达虫荧光素酶的基因工程菌；
步骤六：提取虫荧光素酶；从表达虫荧光素酶的基因工程菌提取虫荧光素酶；
步骤七：虫荧光素酶毒性测试；将虫荧光素酶加入到测试体系中，测试发光值的大小，与对照相比，计算发光抑制率，从而计算得出EC50值。
2.根据权利要求1所述的一种利用荧光素霉快速检测生物毒性的方法，其特征在于，所述引入的突变位点克隆得到的基因片段为luc-I232K和luc-I232K-F465R。
3.根据权利要求1所述的一种利用荧光素霉快速检测生物毒性的方法，其特征在于，所述步骤二中克隆载体为pBBR1-MCS4。
4.根据权利要求1所述的一种利用荧光素霉快速检测生物毒性的方法，其特征在于，所述步骤四中表达载体为pET-30a(+)。
5.根据权利要求1所述的一种利用荧光素霉快速检测生物毒性的方法，其特征在于，所述步骤七中测试体系包括虫荧光素100μmol/L，牛血清白蛋白0.05％(v/v),Triton X-1000.01％(v/v),ATP 100μmol/L,Mg2+7mmol/L和有毒物质；所述测试体系与虫荧光素酶体积比为19:5。
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