[发明专利]采用脂肪酶选择性催化微拟球藻联产二十碳五烯酸和生物柴油的方法

说明书

本发明属于二十碳五烯酸和生物柴油的制备，特别是指一种采用脂肪酶选择性催化微拟球藻联产二十碳五烯酸和生物柴油的方法。包括培养微拟球藻、湿微拟球藻破壁、脂肪酶A的转酯化反应制备生物柴油和EPA、富含EPA藻油和生物柴油的分离等工艺步骤；本发明解决了现有技术存在的生物柴油的生产成本较高以及EPA在藻油中的含量低的技术难题。具有所制备的生物柴油的密度、运动黏度和十六烷值等主要技术指标符合国标要求，可大幅度降低生物柴油的生产成本，藻油中EPA含量高等优点。

技术领域

本发明属于二十碳五烯酸和生物柴油的制备，特别是指一种采用脂肪酶选择性催化微拟球藻联产二十碳五烯酸和生物柴油的方法。

背景技术

近年来，微拟球藻是最有潜力被开发成微藻高附加值产品和生物柴油的藻种之一。这是因其具有生长速度快，固定二氧化碳效率高，油脂含量高(Mitra et al.,2015；刘婉君，2016；Law et al.,2018)。Lopez等人利用固定化酶(Novozym 435，南极假丝酵母脂肪酶B固定在大孔丙烯酸树脂)催化已处理的微拟球藻藻粉(采用高压均浆法破壁)，可获得生物柴油的转化率达99％(Lopez et al.，2016)。Law等人也利用脂肪酶(脂肪酶来自Rhizimucor miehei)直接催化已处理的微拟球藻藻体(采用高压均浆法破壁)，生物柴油的转化率为90％(Law et al.，2018)。此外，已有大量研究表明利用微拟球藻制备生物柴油的品质指标(如密度、运动黏度和十六烷值)可达到中国生物柴油企业标准(标准代号：Q/WHRD01-2003)、柴油机燃料调合用生物柴油(BD100)(GB/T 20828-2015)和美国生物柴油标准(ASTM D6751-2003)的品质指标(Mitra etal.，2015；刘婉君，2016；孙发强，2015；Lopezetal.，2016；Maeda etal.，2018)。国家质量监督检验检疫总局及国家质量标准化监督委员会于2017年9月1日颁布并实施了由石油化工研究院起草的《B5柴油》的国家标准(标准代号GB 25199-2017)。

为了使生产工艺更节能，目前研究是通过高压均浆法破碎微拟球藻细胞(Lopezetal.，2016；Law etal.，2018)。但是高压均浆法破碎微藻细胞是一个高能耗的处理过程(Gunerken et al.,2015)，即处理1公斤湿藻体(微藻干重4.1％)需要消耗6.08千瓦时电量(Gunerken et al.，2015)。高能耗的破壁技术大大增加了最终产品的价格。Wu等人研究表明，纤维素酶是酶解破壁微拟球藻的最佳生物催化剂之一(Wu etal.，2017)。这是因为微拟球藻的细胞壁含70％的纤维素(Scholz etal.，2014)。因此利用纤维素酶酶解微拟球藻，再转酯化反应制备生物柴油，可能是一种更经济的方法。

除了生物柴油，微拟球藻细胞还能大量合成二十碳五烯酸(EPA，占总脂肪酸10-40％)(Ma etal.，2016)。众所周知EPA是一种ω-3脂肪酸，具有抗肿瘤、预防心血管疾病、缓解中风和痛风等多种生物学功能。近年来海洋污染严重，现有食用鱼油已检测到杀虫剂、重金属(如汞、砷等)、激素等有害物质，使鱼油源的EPA安全性受到挑战。基于海洋食物链，海鱼摄食含EPA的海洋微藻才能积累海鱼EPA。另外现有资料表明，微拟球藻是一种生产绿色的可再生的EPA新资源。如Mitra等人(Mitra etal.，2015)培养微拟球藻(Nannochloropsisgaditana)可合成19.13％-37.83％EPA(占总脂肪酸)。Law等人利用15升玻璃缸培养微拟球藻(Nannochloropsis salina)，通过高氮和缺氮条件下分别获得EPA含量为14.6％和31％(Law et al.，2018)。但是现有开发微拟球藻生物柴油的研究中(Lopez etal.，2016；Lawetal.，2018)，研究者将微拟球藻的EPA脂肪酸也转化为低值的生物柴油，这无疑是一种资源的浪费。