[发明专利]一种无标记Kappa受体的细胞筛选模型

说明书

本发明提供了一种无标记Kappa受体的细胞筛选模型，基于无标记细胞整合药理学技术，利用Kappa稳定表达的细胞系，建立了筛选Kappa受体的激动剂和拮抗剂的方法。此方法还可以用于研究影响Kappa受体下游通路的调节剂。本发明具有无损伤、高时空分辨、高灵敏度、高通量、能靶点‑通路整合研究及操作简单、实验周期短等特点，检测过程无需标记及额外指示剂的添加，更真实的响应药物在活细胞整体水平的作用；可大大提高Kappa的激动剂、拮抗剂及通路调节剂的发现效率，对阐述Kappa的药理学和生理学功能具有重大意义，同时为Kappa受体参与的镇痛和调节胃肠蠕动、情绪、行为及心血管等相关疾病的药物筛选提供指导。

技术领域

本发明涉及细胞筛选领域，具体涉及一种无标记Kappa受体的细胞筛选模型。

背景技术

G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptor,GPCR)是细胞信号传导中最重要的一类膜受体，也是小分子药物开发中最受关注的药物靶点之一，约34％的现代药物直接靶向该受体家族。Kappa受体属阿片类受体，也是一种G蛋白偶联受体。Kappa受体的克隆最早是在生长抑制素受体亚型杂交筛选过程中偶然发现的，由380个氨基酸残基组成，氨基端胞外区有2个N-糖基化位点，第一和第二胞外环区各含有一个彼此间能形成二硫键的半胱氨酸(Cys)，在胞内环区和羧基端存在一些磷酸化位点；Kappa受体主要分布于脑中，在人的胎盘中也有存在。克隆的Kappa受体与内源性强啡肽有很高的亲和力，能够介导cAMP的生成抑制作用，并且介导Ca²⁺通道活性的抑制。进一步的研究证明Kappa阿片受体在心脏慢性缺氧时可调节β-肾上腺素受体信号作用；除此之外，Kappa受体作为一种阿片受体在机体镇痛应用方面也有不少报道。阿片类药物在临床中被广泛用于镇痛，但大多都具有严重的耐受成瘾性，开发全新的或新的作用机制的镇痛药物是解决成瘾性问题的有效途径.近年来研究发现，滥用药物会激活Kappa阿片类药物系统，这可能在药物依赖机制方面发挥关键作用。因此，建立Kappa受体药物筛选模型并开发应用Kappa受体药物具有十分重要的意义。

目前受体的高通量筛选方法主要有传统的放射性配体受体结合实验法、GTPγS结合实验法、环磷酸腺苷(cAMP)分析法、钙流检测法、报告基因检测法、受体的内吞检测法及β-arrestin的招募检测法等。但这些方法都有一定的局限性，如传统的放射性配体受体结合实验法需要洗涤和过滤，实验周期长及通量低等不足，此技术还不能区分受体的激动剂和拮抗剂；其余的GPCR检测方法主要针对某条信号通路的激活，往往不考虑多条通路的激活，常常需要荧光蛋白标记或者额外加入指示剂，使操作变得繁琐，而且这些指示剂的加入对细胞也会产生一定的损伤，影响筛选结果的可靠性。

目前关于本发明中提到的采用无标记细胞整合药理学技术构建无标记Kappa受体的细胞筛选模型尚未报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，借助于新型无标记细胞整合药理学技术，提供一种无标记Kappa受体的细胞筛选模型，以高通量筛选Kappa受体激动剂、拮抗剂和通路调节剂。

本发明的技术方案为：

基于无标记细胞整合药理学技术，利用稳定表达Kappa的细胞系HEK-293-Kappa，借助于已知的激动剂和拮抗剂，建立Kappa受体的细胞筛选模型。根据待测样品的DMR信号谱与已知激动剂和拮抗剂的DMR特征信号谱的相似性，判断待测样品的激动活性、拮抗活性或者下游通路的调节影响。

所述的无标记细胞整合药理学技术为利用共振波导光栅(RWG)生物传感器将药物导致的细胞内成分的动态再分布现象转化为整体的、动态的波长位移响应信号，此信号为波长变化的响应值(pm)，通过Epic光学生物传感器384微孔板实现。

一种无标记Kappa受体的细胞筛选模型的建立过程为：