[发明专利]一种鉴定水稻垩白相关基因PPDKB的分子标记、鉴定方法及应用

权利要求书

1.一种鉴定水稻垩白相关基因PPDKB基因型的方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、采用CTAB法分别提取参照水稻品种和待测水稻品种的基因组DNA；

S2、以S1步骤中获取的基因组DNA为模板，以PPDKB-M8501-F和PPDKB-M8501-R为上下游引物进行PCR扩增，所述PPDKB-M8501-F的序列为SEQ ID NO.1所示，所述PPDKB-M8501-R的序列为SEQ ID NO.2所示；

S3、通过6％聚丙烯酰胺凝胶对S2步骤中获取的PCR产物进行电泳分离，经银染显色后拍照备用；

S4、结果判定：观察S3步骤中的电泳图像，若待测水稻品种能扩增出与参照水稻品种大小一致的片段，则表明待测水稻品种中含有与参照水稻品种相同的PPDKB基因；若待测水稻品种扩增出与参照水稻品种大小不一致的片段，则表明待测水稻品种中含有与参照水稻品种不同的PPDKB基因。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述S1步骤中的基因组DNA提取，包括以下步骤：

W1、将0.5g新鲜水稻叶片剪碎后装入2mL的离心管中，并往离心管内放入一粒钢珠，然后往其中加入600μL CTAB提取液，盖好管盖后置于打样机上以23～26r/s的速度振动1min；

W2、65℃水浴30min，期间每隔10min震荡混匀1次；

W3、打开离心管，加入600μL氯仿并充分摇匀，静置5min后以12000rpm的转速离心8min；

W4、从W3步骤的2mL离心管中吸取400μL上清液至事先准备好的1.5mL离心管中，然后往1.5mL离心管内加入1mL事先经过-20℃预冷的无水乙醇，摇匀后置于-20℃冰箱中静置20min，最后以12000rpm的转速离心10min；

W5、将W4步骤的1.5mL离心管中的液体倒掉，待离心管内的白色絮状沉淀风干后往其中加入200μL ddH₂O，轻轻摇晃使沉淀溶解得到水稻品种的基因组DNA，最后置于-20℃保存备用。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系为：10xPCR反应缓冲液 2μL，浓度为5pM的PPDKB-M8501-F引物和PPDKB-M8501-R引物各1μL，10mM dNTP 0.5μL，25ng/μL DNA模板 2μL，5U/μL TaqDNA聚合酶 0.5μL，加ddH₂O补足至20μL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，35次循环；72℃再延伸10min，4℃冷却10min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述S4步骤中的电泳分离的程序为：先以80V的恒定电压电泳10min，然后将电泳升高至120V，恒压电泳2-2.5h。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述S4步骤中的银染显色，包括以下步骤：

Z1、固定：将电泳结束后的聚丙烯酰胺凝胶置于固定液中固定10min，固定好后用ddH₂O清洗3次，每次清洗1min，所述固定液的配方为：100mL无水乙醇，5mL冰醋酸，ddH₂O定容至1000mL；

Z2、银染：将聚丙烯酰胺凝胶置于银染液中染色30min，银染好后用ddH₂O清洗15-20s，所述银染液的配方为：2g AgNO₃，500μL浓度为37％的甲醛，ddH₂O定容至1000mL；

Z3、显色：将聚丙烯酰胺凝胶置于显色液中显色5-10min，所述显色液的配方为：100g碳酸钠，150μL浓度为50mg/mL的硫代硫酸钠，2mL浓度为37％的甲醛，ddH₂O定容至1000mL；

Z4、终止：将显色后的聚丙烯酰胺凝胶置于固定液中放置10-30min，终止显色反应；

Z5、对显色后的聚丙烯酰胺凝胶进行拍照备用。