[发明专利]一种牛奶中氨基糖苷类药物的检测方法

权利要求书

1.一种牛奶中氨基糖苷类药物的检测方法，包括：

(1)提取：向牛奶中加入三氯乙酸溶液和乙腈涡旋混合，超声提取，离心，取上清液，加入氨水调节pH至7.0～7.5，再离心，取上清液过已活化的MIP固相萃取柱，依次用水和乙腈淋洗小柱并抽干，弃去流出液，加入洗脱液，收集全部洗脱液，氮吹至干，加入复溶液溶解，过滤，供高效液相色谱－串联质谱仪测定；

(2)配制基质标准工作溶液：分别在7份空白样品中添加不同浓度混合标准溶液，按上述步骤(1)处理，得到7个浓度的氨基糖苷类系列基质标准工作溶液；其中，浓度范围为2.0～1000μg/L；

(3)高效液相色谱－串联质谱法HPLC-MS/MS测定：

液相色谱条件：色谱柱：SiELC Obelisc R色谱柱；柱温：40℃；流速：0.4mL/min；进样量：10μL；流动相：含2mM乙酸铵的甲酸水，乙腈水；

质谱条件：质谱仪：AB SCIEX6500；离子源：电喷雾离子源ESI；电离模式：正离子扫描；监测方式：多反应监测MRM；离子化电压：5500V；气帘气压力：30Psi；雾化气压力：55Psi；辅助加热气：60Psi；离子源温度：450℃；碰撞气CAD：Medium；

标准工作曲线的制定及定量分析：将步骤(2)中系列基质标准工作溶液进行HPLC-MS/MS测定，将得到的氨基糖苷类药物的峰面积与相应的浓度进行回归分析，计算得出氨基糖苷类药物的标准工作曲线及其回归方程；将步骤(1)中样品液在相同条件下进行HPLC-MS/MS测定，测得样品液中氨基糖苷类化合物的色谱峰面积，代入相应标准曲线，得到牛奶样品液中氨基糖苷类药物浓度，计算得到牛奶样品中氨基糖苷类药物的残留量；

其中，所述氨基糖苷类药物为巴龙霉素、妥布霉素、庆大霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、安普霉素、链霉素、双氢链霉素、新霉素、壮观霉素和潮霉素B。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中三氯乙酸溶液的浓度为5％；所述洗脱液为400mL乙腈、100mL水、5mL甲酸和325μL七氟丁酸的混合溶液；所述复溶液为80mL乙腈、20mL水和250μL甲酸的混合溶液。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中涡旋混合的时间为1min；超声提取的时间为30min；离心温度为4℃，离心转速为10000rpm，离心时间为10min；氮吹的温度为45℃；过滤的工艺条件为：采用0.22μm有机相滤膜过滤。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中MIP固相萃取柱为50mg/3mL SupelMIP SPE-Aminolycosides；MIP固相萃取柱活化的工艺条件为：依次采用1mL甲醇、1mL50mM pH＝7.0～8.0的磷酸二氢钾溶液活化。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中巴龙霉素、妥布霉素、庆大霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、安普霉素、链霉素、双氢链霉素和新霉素的标准工作溶液浓度分别为2.0、4.0、8.0、20、40、100、200ng/mL；壮观霉素和潮霉素B的标准工作溶液浓度分别为10、20、40、100、200、500、1000ng/mL。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中流动相梯度洗脱条件为：乙腈水的初始体积分数为95％；0-0.5min，乙腈水的体积分数保持95％；0.5-3.0min，乙腈水的体积分数降低至55％；3.0-4.0min，乙腈的体积分数保持55％；4.0-6.0min，乙腈水的体积分数降低至5％；6.0-8.0min，乙腈的体积分数保持5％；8.0-8.2min，乙腈水回到初始状态，并保持至12.0min。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中氨基糖苷类药物的质谱条件参数为：巴龙霉素：母离子为308.4m/z，子离子分别为161.1m/z和163.2m/z；妥布霉素：母离子为468.3m/z，子离子分别为163.1m/z和324.2m/z；庆大霉素：母离子为478.3m/z，子离子分别为322.2m/z和157.2m/z；卡那霉素：母离子为485.3m/z，子离子分别为163.1m/z和324.3m/z；丁胺卡那霉素：母离子为586.3m/z，子离子分别为264.1m/z和425.1m/z；安普霉素：母离子为540.3m/z，子离子分别为217.1m/z和378.2m/z；链霉素：母离子为582.3m/z，子离子分别为246.2m/z和263.3m/z；双氢链霉素：母离子为584.3m/z，子离子分别为246.2m/z和263.3m/z；新霉素：母离子为615.1m/z，子离子分别为161.2m/z和163.2m/z；壮观霉素：母离子为351.3m/z，子离子分别为207.2m/z和333.1m/z；潮霉素B：母离子为528.3m/z，子离子分别为177.2m/z和352.1m/z。