[发明专利]可在大肠杆菌中实现重组子筛选的乳酸菌分泌型载体及其构建方法、应用

说明书

本发明属于生物工程领域。本发明公开了一种可在大肠杆菌中实现重组子筛选的乳酸菌分泌型载体，其包括氨苄抗性基因序列大肠杆菌复制子ori、大肠杆菌组成型启动子P32、乳酸菌分泌信号肽USP45、多克隆位点及大肠杆菌不耐热性肠毒素LTB基因序列；本发明还公开了一种可在大肠杆菌中实现重组子筛选的乳酸菌分泌型载体的构建方法；本发明还公开了一种可在大肠杆菌中实现重组子筛选的乳酸菌分泌型载体的应用。通过本发明中的可在大肠杆菌中实现重组子筛选的乳酸菌分泌型载体的构建方法能够获得一种可在大肠杆菌中实现重组子筛选的乳酸菌分泌型疫苗载体。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其是涉及一种可在大肠杆菌中实现重组子筛选的乳酸菌分泌型载体及其构建方法、应用。

背景技术

乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB) 是一群能大量发酵碳水化合物并产生乳酸的革兰阳性细菌, 是人和大多数动物肠道内的常见细菌, 安全无毒素，被公认为安全级(generaly recoas safe, GRAS) 微生物。乳酸菌载体口服疫苗作用于粘膜系统的具体机制在于粘附于机体粘膜上可以在粘膜部位持续不断的合成和释放抗原蛋白，可以刺激产生特异性分泌型IgA，且刺激产生的IgA抗体效价比直接注射纯化的抗原蛋白产生的抗体效价高。也有研究表明，乳酸菌载体疫苗通过鼻饲免疫而诱发抗体特异性的细胞免疫，检测到Th1细胞因子（Th1 cytokines）、白介素-2（IL-2）和干扰素-γ（IFN-γ）的表达量的变化。使用乳酸菌载体疫苗抗癌细胞生长，主要通过CD4+和CD8+依赖的TC细胞反应途径。

外源蛋白在乳酸菌载体中的高效表达的调节可通过组成型和诱导型的启动子来实验，组成型表达的乳酸菌表达系统，外源蛋白可以利用乳酸菌的蛋白表达系统持续的表达，而诱导型的则需要诱导物、抑制物活环境因子的诱导才能实现大量表达。利用乳酸菌蛋白表达系统，在乳酸菌表达载体中插入蛋白分泌系统中的信号肽，可以实现外源蛋白在乳酸菌表面或胞外的表达分泌，满足不同的实验要求。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种可在大肠杆菌中实现重组子筛选的乳酸菌分泌型载体；

本发明还提供了一种可在大肠杆菌中实现重组子筛选的乳酸菌分泌型载体的构建方法；

本发明还提供了一种可在大肠杆菌中实现重组子筛选的乳酸菌分泌型载体的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种可在大肠杆菌中实现重组子筛选的乳酸菌分泌型载体，其包括氨苄抗性基因序列大肠杆菌复制子ori、大肠杆菌组成型启动子P32、乳酸菌分泌信号肽USP45、多克隆位点及大肠杆菌不耐热性肠毒素LTB基因序列。

作为优选，可在大肠杆菌中实现重组子筛选的乳酸菌分泌型载体还包括氨苄抗性基因序列。

作为优选，可在大肠杆菌中实现重组子筛选的乳酸菌分泌型载体还包括PBR322复制子。

作为优选，大肠杆菌组成型启动子P32和乳酸菌分泌信号肽USP45后存在多克隆位点。

作为优选，大肠杆菌不耐热性肠毒素LTB基因序列位于多克隆位点后。

作为优选，可在大肠杆菌中实现重组子筛选的乳酸菌分泌型载体位于大肠杆菌Dh5α中。

作为优选，可在大肠杆菌中实现重组子筛选的乳酸菌分泌型载体通过电击转化的方式存在于干酪乳杆菌中。

一种可在大肠杆菌中实现重组子筛选的乳酸菌分泌型载体的构建方法包括以下步骤：

依次制备获得氨苄抗性基因序列大肠杆菌组成型启动子P32、乳酸菌分泌信号肽USP45、多克隆位点、大肠杆菌不耐热性肠毒素LTB基因序列获得可在大肠杆菌中实现重组子筛选的乳酸菌分泌型载体。