[发明专利]一种抑制植物病毒的人工miRNA及其构建和用途

权利要求书

1.一种抑制植物病毒的人工miRNA，其特征在于，该miRNA具体为SEQ ID NO：5-SEQ IDNO：8中的任一所述序列的miRNA。

2.一种根据权利要求1所述的一种抑制植物病毒的人工miRNA的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、amiRNA的设计：通过靶基因上的作用位点，利用限制性内切酶、RNA连接酶以及RNA聚合酶，实现对靶基因上的基因片段进行剪切以及重新排列组合；

S2、克隆miRNA前体基因(即permiRNA)：将0.5-1.0mg/L的磷酸、15-25ml的二甲基甲酰胺、2.5-5.6mg/L的糖原以及3.25-5.5mg/L的MgCl₂溶液混合，保持温度30-40摄氏度下，加入寡核苷酸引物以及寡核苷酸，静置3-4h；

S3、采用重叠PCR扩增的方法以内源miRNA前体为主要骨架进行miRNA的构建；

S4、受体细胞的培养：利用细胞的全能性，将植物的细胞在培养基中进行培养，培养1-3天，使得分化细胞进行脱分化以及再分化后得到实验所需的受体材料；

S5、转化载体的制备：

1)、利用化学合成编码miRNA，得到单链的RNA的分子片段，单链的RNA分子片段的两端均带有限制性内切酶黏性平末端；

2)、将1)中得到的单链RNA分子片段利用高速基因枪射入培养后的植物的受体细胞中的限制内切酶位点间，得到件表达的转化载体；

S6、通过转基因技术将转化载体植入植物体中，利用植物自身的miRNA加工后的作用，使得靶基因进行沉默；

S7、检测：取移植完成后，且生长状况良好的植株，注入相关的植物病毒，2-5天后，通过观察植株的生长情况，对实验的结果进行判断。

3.根据权利要求2所述的一种抑制植物病毒的人工miRNA的构建方法，其特征在于，在S3中重叠PCR扩增的方法具体为采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组。

4.根据权利要求2所述的一种抑制植物病毒的人工miRNA的构建方法，其特征在于，在S4中将装有受体细胞的培养基平均分成6-10份，分别装入写有不同标号的培养皿中，用于备用。

5.根据权利要求2所述的一种抑制植物病毒的人工miRNA的构建方法，其特征在于，S4中的培养基具体为MS液体培养基，且在培养基中加入2-5mg/L的2,4-D、1％的甘露醇以及3％的蔗糖，保持温度在26-30摄氏度范围内，PH值在5.1-5.7之间。

6.根据权利要求2所述的一种抑制植物病毒的人工miRNA的构建方法，其特征在于，在进行S4进行前，需要对培养基进行无菌处理，在S4的受体培养的过程中，若出现MS培养基凝固性较差的情况时，应加入浓度为10mg/L的MES缓冲试剂。

7.根据权利要求1所述的一种抑制植物病毒的人工miRNA的用途如下：

1)、通过分子生物学手段对基因组进行修饰，使得某些miRNA的水平上升或者下降，从而起到高效影响作物性状的功能；

2)、通过输入人造的miRNA，或者与miRNA配对的分子，来提高或者降低体内miRNA的水平，从而起到调节下游基因表达，最终实现抗病效果。