[发明专利]用于从预文库中富集靶标序列的试剂盒、制备方法和应用

说明书

本申请公开了一种用于从预文库中富集靶标序列的试剂盒、制备方法和应用。本申请的试剂盒包括蛋白核酸复合物、DNA连接酶和捕获接头；蛋白核酸复合物由Cas酶和RNA引导序列组装成，RNA引导序列能特异性与靶标序列结合，Cas酶将靶标序列切割；DNA连接酶将捕获接头连接到被切割的靶标序列；然后通过捕获接头或捕获接头与靶标序列连接时的polyA尾的修饰将靶标序列分离、富集。本申请的试剂盒，利用蛋白核酸复合物精准识别和切割靶标序列，采用不同的RNA引导序列，可以富集多个靶标区域，且没有多重PCR富集的偏好性，可检测点突变、小插入和缺失、基因融合等多种变异类型，使用简单、成本低廉、准确度高。

技术领域

本申请涉及DNA富集领域，特别是涉及一种用于从预文库中富集靶标序列的试剂盒、制备方法和应用。

背景技术

当前科技的高速发展使DNA测序在医学、农业、环境、工业等各个领域得到广泛应用。新一代测序技术(NGS)的高速发展使全基因组测序成本不断降低。但是目标区域富集测序由于其检测成本更低，目标基因检测质量高，准确度好，仍然是新一代测序技术在各种测序应用中最常见的方法手段。

目前比较常见的目标区域富集测序方法主要分三类：多重PCR富集方法、基于探针杂交的捕获方法、反向分子探针杂交方法。

多重PCR富集方法是应用非常广泛的一种方法，该方法应用多对引物同时对多个目标区域进行扩增，并最终构建成NGS文库进行测序；该方法引物设计较简单，成本低廉，便于操作。但是，该方法的缺点是随着目标区域增多，引物之间的相互干扰越来越大，会产生大量的非特异性扩增，甚至会出现没有目标区域扩增的情况。另外，由于不同的扩增子其碱基序列GC含量等差异，在一个扩增体系中会出现严重的扩增偏好性，进而造成浪费测序数据的现象。

基于探针杂交捕获的方法是将捕获探针固定在捕获芯片上，或者游离在液体试剂中，探针长度一般为60ng-120nt之间，捕获区域可以长达几个Mb；该方法操作比较复杂，操作时间长，灵敏度低，往往需要比较大量的样本才能进行杂交捕获。

分子反向探针杂交法是近几年出现的一种新方法。分子反向探针在两端含有待捕获区域的两端同源序列，可以杂交到相关区域上形成环状。经过酶延伸并且连接后即形成一个分子环。待消化掉未形成环的非目标分子后再通过反向PCR扩增的方法将目标区域分子扩增下来形成文库。该方法特异性高，操作较简便。但是反向探针设计很复杂，做多个区域捕获时成本高昂。

因此，为了满足日益广泛的基因测序需求，研发一种更有效的目标DNA富集试剂或方法，是本领域的研究重点。

发明内容

本申请的目的是提供一种新的用于从预文库中富集靶标序列的试剂盒、制备方法和应用。

为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种用于从预文库中富集靶标序列的试剂盒，包括蛋白核酸复合物、DNA连接酶和捕获接头；蛋白核酸复合物由Cas酶和RNA引导序列组装而成，RNA引导序列能够特异性的与靶标序列结合，Cas酶能够特异性的识别与RNA引导序列结合的靶标序列，并将靶标序列切割；DNA连接酶用于将捕获接头连接到被切割的靶标序列的切割末端；捕获接头为一段DNA序列，用于将靶标序列从预文库中区分开来，并通过捕获接头的修饰将靶标序列分离、富集；或者通过在将捕获接头与靶标序列切割末端连接时的polyA尾的修饰将靶标序列分离、富集。