[发明专利]一种快速定量检测VBNC状态副溶血性弧菌的方法

说明书

本发明提供了一种快速定量检测VBNC状态副溶血性弧菌的方法，包括如下步骤：S1.诱导副溶血性弧菌进入VBNC状态；S2.生物素化多克隆抗体和免疫磁珠的制备；S3.免疫磁珠富集，免疫磁珠所需体积为10μL~200μL，副溶血性弧菌菌液所需体积为0.5~1mL；S4.PMAxx染色：在步骤S3富集后的样品中加入PMAxx使其终浓度达到10~20μmol/L，染色后进行检测。本发明提供了一种快速定量检测VBNC状态副溶血性弧菌的方法，首次将免疫磁珠技术、PMAxx染料以及qPCR定量检测技术相结合应用于实际样品免前增菌条件下VBNC状态菌的检测中。通过实验能够证明，该方法对VBNC状态副溶血性弧菌的检测限为1.05CFU/g，该方法不仅灵敏度高且特异性好。

技术领域

本发明属于食源致病菌快速定量检测技术领域，更具体地，涉及一种副溶血性弧菌的定量检测，特别是涉及活的不可培养状态的副溶血性弧菌的快速定量检测。

背景技术

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus, VP）是广泛分布于近海区域、盐湖及海产品中的革兰氏阴性短杆嗜盐菌，能感染鱼类、对虾、甲壳类等多种水产动物，人畜食用了受该菌污染的海产品后，会出现食物中毒及腹泻等症状，它是一种可引起食源性疾病的病原菌。在一些沿海的城市中，由副溶血性弧菌引起的食物中毒事件比例高达60％。活的非可培养状态（Viable but nonculturable state, VBNC）是细菌受到外界不利环境胁迫时，通过调整自身代谢途径进入的一种自我保护的状态。目前，已有大量文献证明，处于VBNC状态的致病菌仍具有致病性，复苏后能够引起人类疾病。海水是一个常年维持在较低温度（约4℃）且营养缺失的载体，副溶血性弧菌在此低温寡营养条件下可进入VBNC态，这一点已被相关研究证实。另外海产品经捕捞后自身可能携带副溶血性弧菌，在加工、运输、储存过程中，由于存在着各种各样的环境胁迫因素，如高温、低温、寡营养、极端pH 等，均可能导致其进入VBNC 状态。进入VBNC状态的副溶血性弧菌因具有不可培养性，采用传统的平板检测方法无法将其检出，给食品安全带来巨大隐患。

对于VBNC状态的致病菌的检测，目前常用叠氮溴化丙锭（PMA）和荧光定量PCR（qPCR）相结合的方法，但是，该方法仍具有一些不足：1、对于污染水平低的样品，现有检测方法很难将其准确检测出，因此需要在检测前进行增菌处理，但在增菌的过程中一些干扰微生物同样会进行繁殖，为检测结果带来较大的影响。2、PMA能够在qPCR反应中抑制死菌的扩增，能够有效地区分出活菌和死菌，但是它并不能够完全排除来自死细胞DNA的PCR产物，从而带来潜在的“假阳性”结果。针对上述污染水平低，检测准确性差以及“假阳性”等问题，我们提出一种新颖的检测方法，将免疫磁珠分离技术（Immunomagnetic separation,IMS）、PMAxx染料和荧光定量PCR三者相结合，应用于VBNC状态致病菌的检测。

IMS是一种免疫学分离技术，磁珠表面活化与活性蛋白质偶联形成免疫磁珠，能够与目标致病菌表面的抗原特异性结合，并在磁场的作用下形成IMS-目标菌复合物，从而达到富集分离的效果。对于一些污染程度较低的样本，采用免疫磁珠富集技术能够准确有效地捕获到目标致病菌，从而达到富集的目的。因此，不需要离心、过滤和增菌的过程，就可以从食品基质溶液中富集食源致病细菌，IMS是一种快速、特异、高效、操作简单富集方法。PMA的