[发明专利]检测宠物源性人兽共患病的多重PCR引物探针及试剂盒

说明书

本发明提供了检测宠物源性人兽共患病原的多重PCR引物探针及试剂盒，本发明对属于宠物源性人兽共患病原的汉赛巴尔通体、刚地弓形虫，布鲁氏菌基因序列分析和比对，设计了适于单反应同时检测这3种病原的三重荧光PCR检测引物和探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑9所示，本发明还提供了对上述3种病原进行检测的方法和检测试剂盒。本发明的检测方法简化了原有2/3以上的检测工作量，并缩短检测时间1小时左右，对于汉赛巴尔通体、刚地弓形虫，布鲁氏菌的检测灵敏度分别为5、5、50个拷贝。对临床常见23种病原体以及犬、猫染色体均无非特异扩增，显示出良好的特异度。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用于检测汉赛巴尔通体、刚地弓形虫，布鲁氏菌这三种宠物源性人兽共患病的荧光定量PCR引物和探针及试剂盒。

背景技术

随着人们生活水平的提高，城市宠物数量猛增。宠物已逐渐成为许多家庭的一个重要部分，甚至以家庭成员相待,与人类接触甚为密切。但是，宠物给人们的生活带来乐趣的同时也给人们带来了难以察觉的隐患。威胁着人类的健康。宠物疫病的控制已成为国际社会共同关注的问题之一。猫和犬是目前国内最常见的宠物，据不完全统计与宠物犬、猫有直接或间接关系的达70多种。这些人兽共患病原通过宠物生理性的呼吸、唾液，病理表现如咳嗽、流鼻涕、呕吐、腹泻等或者日常接触中的不经意抓挠，直接或者间接的传染给人类。尤其老人、孕妇和儿童是最易感染的群体。

其中在猫或者犬中携带率较高，感染症状较为隐匿不易被发现，但是感染人后可引起严重疾病的几种人畜共患病有弓形虫病、猫爪病以及布病。其中弓形虫病是由刚地弓形虫引起的一种严重的人兽共患病。弓形虫眼病、肝病的临床报道屡见不鲜，甚至可以引起弓形虫脑病，更是免疫功能低下和免疫功能缺陷者最为常见的感染来源和死亡原因之一。孕妇感染可以导致胎儿畸形、流产、死胎等不良孕产结果，是计划生育、优生优育的大敌。猫爪病是由汉赛巴尔通体引起，传染源主要是带菌的猫，常见与在1岁以下的小猫，犬类也可携带病原，成为传染源。病原体存在于宠物的口咽部，宠物受染后可形成菌血症，并可通过身上的跳蚤在猫群中传播，故猫的带菌率相当高。有报道宠物猫的感染率达40％。人通常是在被猫或者犬抓伤、咬伤或与猫密切接触后而感染。据报告，全球每年猫抓病的发病人数超过4万例，以青少年和儿童居多。布病由布鲁氏杆菌属的细菌引起的人与多种动物共患的慢性传染病。带菌患犬是最主要传染源，猫也可携带病原成为传染源。宠物多呈隐性感染，最危险的传染源是受感染的怀孕母犬，分娩或流产时排出大量病原菌，甚至乳汁中都含有该菌。经口感染是主要的传播途径，经皮肤感染也较常见，不仅可损伤皮肤，亦可由健康皮肤侵入机体而致病，呼吸道也可感染此病。

面对严重威胁人类安全与发展的人畜共患病，相对于个人的自我防护，更为重要的是对各种人畜共患病进行控制，做到早发现、早报告、早处理，严格防止某些疾病的暴发和传播。提高诊断技术，要把此病有效地控制在侵袭人类之前。要认识到防控此病中动物所起的重要作用，更要认识动物卫生和疫病的控制的重要性，所以要有效地控制源头，人类的病也就控制了。既然知道了此病防控中人和动物的位置同等重要，就要提高疫病诊断能力，开发相关诊断试剂盒。才能更有效地降低人畜共患病的发生和流行，防止由此给人类带来更大的灾难。

上述3种常见的宠物源性人兽共患病原体培养难度大、周期长、且危险性较大，不推荐使用病原培养作为检测的标准。目前，核酸检测技术凭借快速、高灵敏度和特异度的优势，越来越广泛的应用于弓形虫、巴尔通体及布病感染的实验室检测。国内外已报道相关病原体荧光PCR检测体系，检测灵敏度和特异度均超过传统的血清学检测和普通PCR检测技术。现有的实验室相关病原检测体系其检测灵敏度在几拷贝到几十个拷贝之间。目前已经有各自相关的核酸实验室检测技术报道，但方法基本局限在实验室检测层面，其检测方案基本也是独立的病原菌进行单独检测，且各自检测使用的具体方法、扩增试剂以及检测条件各不相同，无法进行整合。目前尚未有此三种重要人兽共患病病原同时检测的试剂盒。极大的增加了临床检测工作量和检测成本，降低了检测效率。因此，急需建立一种快速、灵敏、特异的检测技术来提高临床对汉赛巴尔通体、刚地弓形虫，布鲁氏菌的检测能力。

发明内容