[发明专利]金黄色葡萄球菌荧光PCR检测试剂盒

说明书

本发明涉及一种采用实时荧光PCR方法特异性检测样品中金黄色葡萄球菌核酸存在的试剂盒。利用本发明的试剂盒，可快速检测样品中是否存在金黄色葡萄球菌核酸，该试剂盒对金黄色葡萄球菌核酸的检测限为20拷贝每反应体系，整个反应可在2小时内完成，在疾病监测、临床诊断等领域具有重要的应用价值。

技术领域

本发明涉及一种采用实时荧光PCR方法特异性检测样品中金黄色葡萄球菌核酸的试剂盒，属于金黄色葡萄球菌的体外诊断领域。

背景技术

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus Aureus）是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属，是革兰氏阳性菌的代表。该菌可引局部化脓感染；也可引起内脏器官感染，如肺炎、心包炎、心内膜炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶（如溶血毒素、杀白细胞素、血浆凝固酶、脱氧核糖核酸酶、肠毒素等）。毒素性疾病表现有：食物中毒，进食污染肠毒素食物后，经30min至8h潜伏期，即可出现恶心、呕吐、腹部疼痛和腹泻等急性胃肠炎症状，发病1-2天可自行恢复，预后良好。中毒性休克综合征，主要表现为高热、低血压、红斑皮疹伴脱屑和休克等，半数以上患者有呕吐、腹泻、肌痛、结膜及黏膜充血、肝肾功能损害等，偶尔有心脏受累的表现。

在检测中，PCR法由于其快速简便的特点逐渐呈现出要替代以细菌培养和血清学检测为主的传统检测方法的趋势。而对于PCR方法来说，引物的特异性是其检测的特异性和敏感性的基础。

本发明分别针对金黄色葡萄球菌基因序列的保守区域特异的靶序列设计引物和Taqman探针，利用real-time PCR的方法，用来快速检测样品中是否存在金黄色葡萄球菌的核酸。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是快速准确地检测样品中是否存在金黄色葡萄球菌，提供一种特异性检测金黄色葡萄球菌的荧光PCR试剂盒。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种特异性检测样品中金黄色葡萄球菌核酸的试剂盒，组分包括PCR反应液、酶混合液、阴性质控品和阳性质控品。其中PCR反应液主要含有上述的引物和探针、反应缓冲液、Mg2+和dNTP等，酶混合液主要含有热启动Taq酶，阴性质控品为无RNase和DNase水，阳性质控品为含有金黄色葡萄球菌检测靶序列的重组质粒。

PCR反应液中用于核酸扩增的引物为P1和P2，P1和P2为针对金黄色葡萄球菌基因组群特异性保守序列设计并经预实验筛选出的特异性引物；PCR反应液中用于荧光信号监测的寡核苷酸探针为Probe1，Probe1为针对金黄色葡萄球菌基因组群特异性保守序列设计并经预实验筛选出的特异性探针，其中荧光报告基团X1为ROX，荧光淬灭基团Y1为Eclipse（见表1）。

表1 检测金黄色葡萄球菌的引物和探针序列

本发明的另一个目的是提供本荧光PCR检测试剂盒在检测金黄色葡萄球菌的应用方法，包括：

试剂盒选用的PCR反应体系为20 µl，包括2×PCR缓冲液10 µl、10mmol/L dNTP 1.0 µl、25µmol/L引物各0.5 µl、10µmol/L 探针0.2 µl、热启动Taq酶混合液0.4 µl、样品DNA 2µl，加灭菌水至终体系20 µl。

试剂盒的PCR反应循环参数为94℃，2min；进入循环阶段：94℃变性10s，56℃退火50s，72℃延伸15s，共反应40个循环。

质量控制：每次实验应设立阴、阳性对照，阴性对照无Ct值（或Ct值为0），阳性对照Ct值≤30，否则实验结果不成立。

结果判读：