[发明专利]一种从重组毕赤酵母中制备ELABELA多肽的方法

说明书

本发明属于多肽制备方法技术领域，具体涉及一种从重组毕赤酵母中制备ELABELA多肽的方法。合成编码ELABELA多肽的SEQ ID NO.1所示DNA序列，并将这段DNA序列克隆到毕赤酵母表达载体pGAPHαA上，得到重组表达载体pGAPHαA‑ELABELA；然后将重组表达载体pGAPHαA‑ELABELA整合到毕赤酵母染色体中，构建出能够表达ELABELA多肽的重组毕赤酵母；利用重组毕赤酵母表达外源的ELABELA多肽，提取并纯化ELABELA多肽，得到ELABELA多肽。本发明在生物体内制备的纯天然状态多肽，无需化学合成法中采用的二甲基甲酰胺和二氯甲烷等多种有毒有害试剂。

技术领域

本发明属于多肽制备技术领域，具体涉及一种从重组毕赤酵母中制备ELABELA多肽的方法。

背景技术

利用重组细胞表达外源基因是分子生物学研究和生物医药开发中常用的技术。被用来作为表达宿主的细胞包括细菌、真菌(酵母和丝状真菌)、昆虫细胞和哺乳动物细胞。其中酵母是最简单的真核生物细胞，其作为表达宿主具有一系列优点，被用作重组乙肝疫苗或重组人血浆白蛋白等一系列蛋白质的生产。

目前常用来进行基因工程构建的酵母，包括酿酒酵母和毕赤酵母。其中毕赤酵母被广泛用来表达外源蛋白。一系列表达载体被用于构建基因重组的毕赤酵母，包括pPIC9K、pGAPZαA等。

Elabela是一种新近发现的由32个氨基酸组成的人体多肽激素，与apelin13受体相结合，由孕期胚胎滋养细胞表达，研究表明ELABELA多肽与胚胎心血管发育密切相关，Elabela的缺乏与孕妇先兆子痫病症之间存在密切关系。目前Elabela的制备方法主要是化学合成法。化学合成法采用多种有毒有害试剂，如二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷，对操作者和环境均不友好，操作过程需要佩戴防护面具，保持通风，同时废弃物需要做无害化处理。因此需要开发一种不使用二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷等多种有毒有害试剂的生物法。

发明内容

本发明提供了一种从重组毕赤酵母中制备ELABELA多肽的方法，是在生物体内制备的纯天然状态多肽，无需化学合成法中采用的二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷等多种有毒有害试剂。

本发明的第一个目的是提供一种从重组毕赤酵母中制备ELABELA多肽的方法，合成一段编码ELABELA多肽的SEQ ID NO.1所示DNA序列，并将这段DNA序列克隆到毕赤酵母表达载体pGAPHαA上，得到重组表达载体pGAPHαA-ELABELA；然后将构建好的重组表达载体pGAPHαA-ELABELA转化到毕赤酵母染色体中，构建出能够表达ELABELA多肽的重组毕赤酵母；利用重组毕赤酵母表达外源的ELABELA多肽，并将其分泌到酵母培养液上清中，将酵母培养液上清中的ELABELA多肽提取纯化，得到ELABELA多肽。

优选的，重组表达载体pGAPHαA-ELABELA按照以下步骤构建：

合成PCR引物ELAF和ELAR，ELAF:5′-GAA AAG AGA GGC TGA AGC T-3′；ELAR:5′-GTC TAA GGC TAA AAC TCA-3′；以SEQ ID NO.1所示DNA序列为模板，扩增获得elabela基因PCR扩增产物；

合成PCR引物PVF和PVR，PVF:5′-TGA GTT TTA GCC TTA GAC-3′，PVR:5′-TCT CATCGT TTC GAA TA-3′；以毕赤酵母表达载体pGAPHαA为模板，扩增获得pGAPHαA载体PCR产物；

elabela基因PCR扩增产物和pGAPHαA载体PCR产物进行重组连接，得到重组表达载体pGAPHαA-ELABELA。

优选的，所述毕赤酵母表达载体pGAPHαA是在商业化载体pGAPZαA基础上改进得到的，采用潮霉素抗性基因替代了原始pGAPZαA上的zeocin抗性基因。