[发明专利]一种超深渊来源溶菌酶及其制备方法

说明书

一种超深渊来源溶菌酶及其制备方法，涉及Eurythenes gryllus溶菌酶基因的核苷酸序列以及其所编码的氨基酸序列。通过提取Eurythenes gryllus总RNA，经RT‑PCR反转录为cDNA，通过PCR扩增获得了编码溶菌酶基因的核苷酸序列，并鉴定了溶菌酶基因EgLyz。在pET‑His载体构建了适用于原核表达的重组质粒，在大肠杆菌BL21中进行重组蛋白表达，经纯化后的蛋白纯度高，为后续生物活性分析奠定了坚实的基础。通过同源重组表达的溶菌酶，可以克服原料来源难以获取，分离纯化过程复杂繁琐、产量低等不足，为该蛋白能广泛应用于医药、食品和饲料行业等领域奠定基础。

技术领域

本发明涉及溶菌酶，尤其是涉及一种超深渊来源溶菌酶及其制备方法。

背景技术

溶菌酶是一种碱性酶，能够水解粘多糖，主要作用机理是通过催化水解细胞壁中N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰胞壁酸之间形成的β-1,4糖苷键，糖苷键水解后致使细菌细胞壁破裂，破裂的细胞壁会使得内容物逸出从而导致细菌死亡(1、林亲录,等.鸡蛋卵清中溶菌酶的提取与纯化[J].食品科学,2002,(2):43-45.)。研究表明，溶菌酶发挥作用时有较强的底物特异性，当溶菌酶来源不同时，作用的底物也会不同^[3]，已知的溶菌酶按来源不同可分为六大类：(1)鹅型溶菌酶，又称g型溶菌酶(g-type)；(2)鸡型溶菌酶，又称c型溶菌酶(c-type)；(3)T4噬菌体溶菌酶；(4)无脊椎动物溶菌酶，又称i型溶菌酶(i-type)；(5)植物溶菌酶；(6)细菌溶菌酶^[4-9]。近年来i型溶菌酶(i-type)被广泛研究，它作为溶菌酶家族的新成员，在环节动物门、软体动物门、棘皮动物门和节肢动物门中分布比较广泛(2、Ito Y,Yoshikawa A,Hotani T,etal.Amino acid sequences of lysozymes newly purifiedfrom invertebrate simply wide distribution of anovelclassin the lysozymefamily.EurJBiochem,1999,259(1-2):456-461.)。有些溶菌酶含有Destabilase结构域，即失稳酶结构域。失稳酶是在欧洲医蛭中发现的，最初发现其有异肽酶活性，能特异性水解纤维蛋白ε-(γ-Glu)-Lys的交联键，进而使纤维蛋白发生水解(3、Zavalova L L,Basanova AV,Baskova I P.Fibrinogen2fibrin system regulators from bloodsuckers[J].Biochemistry(Moscow),2002,67(1):1352142)。后来，人们又在失稳酶中也发现了糖苷酶活力，于是失稳酶被认为是一种新的溶菌酶，并且进一步被认定为i型溶菌酶。由于失稳酶既具有异肽酶活性，又具有糖苷酶活性，因此称作DL(destabilase-lysozyme)(4、ZavalovaL L,Baskova I P,Lukyanov S A,et al.Destabilase from the medicinal leech is arepresentative of a novel family of lysozymes[J].Biochim Biophys Acta,2000,1478(1):69277；5、Zavalova L L,Baskova I P,Barsova E V,et al.Recombinantdestabilase2lysozyme:synthesis de novo in E.coli and action mechanism of theenzyme expressed in Spodoptera frugiperda[J].Biochemistry(Moscow),2004,69(7):7762781.)。溶菌酶在植物、动物和微生物中被普遍的发现，同时它也是一种对机体无毒害、安全性能很高的碱性小分子蛋白，可以选择性地分解植物及微生物细胞壁，并且对没有细胞壁的人体不会产生降解，目前被普遍应用于食品、饲料和医药行业。