[发明专利]DNA聚合酶及其制备方法、表达基因、表达载体、宿主细胞和试剂盒

说明书

本发明涉及一种DNA聚合酶及其制备方法、表达基因、表达载体、宿主细胞和试剂盒。该DNA聚合酶的表达基因包括编码角质酶的核苷酸序列与编码角质酶的核苷酸序列连接的编码DNA聚合酶的核苷酸序列，上述DNA聚合酶的表达基因能够在宿主细胞中同时独立表达角质酶和DNA聚合酶。在角质酶的作用下，宿主细胞中表达的DNA聚合酶能够游离到宿主细胞外，使得采用上述DNA聚合酶的表达基因制备得到的DNA聚合酶中不含宿主细胞的DNA。

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，特别是涉及一种DNA聚合酶及其制备方法、表达基因、表达载体、宿主细胞和试剂盒。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)是利用单链募核苷酸引物对特异DNA片段进行体外快速扩增的一种方法，可在短时间内使极微量的目的DNA片段特异地扩增上百万倍。PCR在临床检验中有广泛的应用。

PCR的反应体系包括模板、DNA聚合酶、引物、dNTPs及反应缓冲液，其中DNA聚合酶是影响扩增准确性的关键因素。目前的DNA聚合酶主要是由基因工程菌分离纯化的重组蛋白，虽然提纯的DNA聚合酶去除了大部分的杂蛋白、糖类、脂类等杂质，但是因DNA聚合酶一种核酸结合蛋白，在分离基因工程菌与DNA聚合酶的过程中，DNA聚合酶往往容易与基因工程菌的DNA牢固地结合，并且在后续的纯化过程中难以去除。因而，该方法生产的DNA聚合酶在临床应用时，若检测为细菌时，则会容易出现假阳性，造成误诊。

目前解决DNA聚合酶中存在基因工程菌的DNA污染的方法主要有DNA酶解法和离子交换树脂纯化法。DNA酶解法是通过DNA酶将基因工程菌的DNA水解成核苷酸，但是该方法的生产成本高、增加了灭活DNA酶的操作步骤，而且DNA酶若清除不彻底，将影响下游应用。离子交换树脂纯化法利用阴离子交换树脂的离子吸附作用，使基因工程菌的DNA吸附至树脂上，通过离心或过滤，使基因工程菌的DNA与DNA聚合酶分离，从而达到去除基因工程菌的DNA污染的目的，但DNA聚合酶与基因工程菌的DNA形成紧密的结合体，树脂吸附的是游离的DNA，不能吸附结合体的DNA，因此，不能达到彻底去除DNA污染的目的。

发明内容

基于此，有必要提供一种DNA聚合酶及其制备方法、表达载体、宿主细胞和PCR扩增试剂盒以解决对现有的DNA聚合酶中存在基因工程菌的DNA污染的问题。

一种DNA聚合酶的表达基因，包括编码角质酶的核苷酸序列及与编码角质酶的核苷酸序列连接的编码DNA聚合酶的核苷酸序列。

一种表达载体，包括上述DNA聚合酶的表达基因。

一种宿主细胞，包括上述表达载体。

一种DNA聚合酶的制备方法，包括以下步骤：

构建含有DNA聚合酶的表达基因的表达载体，其中，所述DNA聚合酶的表达基因包括编码角质酶的核苷酸序列及与所述编码角质酶的核苷酸序列连接的编码DNA聚合酶的核苷酸序列；以及

将所述表达载体转入宿主细胞，诱导培养转入所述表达载体的宿主细胞，得到所述DNA聚合酶。

一种DNA聚合酶，由上述DNA聚合酶的制备方法制得。

一种PCR扩增试剂盒，包括上述DNA聚合酶。

上述DNA聚合酶的表达基因包括编码角质酶的核苷酸序列及编码DNA聚合酶的核苷酸序列。上述DNA聚合酶的表达基因能够在宿主细胞中同时表达角质酶和DNA聚合酶。在角质酶的作用下，宿主细胞中表达的DNA聚合酶能够游离到宿主细胞外，从而在提取纯化DNA聚合酶时直接离心就可以将宿主细胞与DNA聚合酶分离，避免了因宿主细胞裂解而引起的DNA聚合酶与宿主细胞的DNA结合的问题发生，使得采用上述DNA聚合酶的表达基因制备得到的DNA聚合酶中不含宿主细胞的DNA。

附图说明

图1为实施例3的扩增曲线图。