[发明专利]检测EGFR基因多个突变位点的检测剂组合物及试剂盒

权利要求书

1.一种用于检测EGFR基因多个突变位点的检测剂组合物，该组合物包括：

用于检测19del突变的引物：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10和SEQID No.11。

2.根据权利要求1所述的检测剂组合物，该组合物还包括以下引物：

用于检测L858R突变的引物：SEQ ID No.14和SEQ ID No.15；和/或

用于检测T790M突变的引物：SEQ ID No.18和SEQ ID No.19。

3.根据权利要求1或2所述的检测剂组合物，该组合物还包括以下引物：

用于检测G719X突变的引物：SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24和SEQ IDNo.25；和/或

用于检测L861Q突变的引物：SEQ ID No.28和SEQ ID No.15；和/或

用于检测S768I突变的引物：SEQ ID No.30和SEQ ID No.31。

4.根据权利要求1或2或3所述的检测剂组合物，该组合物还包括以下引物：

用于检测20ins突变的引物：SEQ ID No.34、SEQ ID No.35、SEQ ID No.36、SEQ IDNo.38和SEQ ID No.39。

5.根据权利要求1～4任一项所述的检测剂组合物，该组合物还包括用于检测19del、L858R、T790M、G719X、L861Q、S768I和/或20ins的探针，所述探针的荧光基团选用FAM、VIC、ROX和/或CY5，淬灭基团选用BHQ和/或MGB；

优选地，针对一个反应孔同时使用四种不同荧光基团标记的探针；进一步优选的探针的标记组合为5’FAM-3’MGB、5’VIC-3’BHQ1、5’ROX-3’MGB和5’CY5-3’BHQ3；

更进一步优选地，所述探针选自：SEQ ID No.12、SEQ ID No.16、SEQ ID No.20、SEQ IDNo.26、SEQ ID No.32和SEQ ID No.39。

6.根据权利要求1～5任一项所述的检测剂组合物，该组合物还包括Blocker引物；优选地，Blocker引物3'端使用MGB修饰，5'端无修饰，Blocker引物长度为13～28bp，自3'端第一个碱基起至5'端有连续13～18个碱基与野生型序列完全互补；

更优选地，Blocker引物选自：SEQ ID No.13、SEQ ID No.17、SEQ ID No.21、SEQ IDNo.29、SEQ ID No.33和SEQ ID No.40。

7.根据权利要求1所述的检测剂组合物，该组合物还包括内控引物和内控探针，内控探针采用5’VIC-3’BHQ1修饰，内控引物和内控探针识别的区域选自EGFR其他外显子上相对保守区域；

优选地，内控引物包括：SEQ ID No.41和SEQ ID No.42；内控探针包括SEQ ID No.43。

8.一种用于检测EGFR基因多个突变位点的检测试剂盒，该试剂盒包括根据权利要求1～7任一项所述的检测剂组合物；

优选地，所述试剂盒还包括：包含热启动Taq酶、UNG酶和酶稀释液的混合酶液，阳性质控品和阴性对照品。

9.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其中，

用于检测19del、L858R、T790M的引物、探针配制成第一反应预混液；

用于检测G719X、L861Q、S768I的引物、探针配制成第二反应预混液；

用于检测20ins的引物、探针配制成第三反应预混液。

10.一种用于检测EGFR基因多个突变位点的方法，该方法包括：利用权利要求1～7任一项所述的检测剂组合物或权利要求8～9任一项所述的检测试剂盒，对进行多重荧光qPCR反应，以检测组织DNA和cfDNA中突变；

优选地，所述反应利用实时荧光定量PCR仪进行，PCR仪的反应程序设置为：

第一步：温度37℃时间5min不采集荧光；循环数1；

第二步：温度95℃时间5min不采集荧光；循环数1；

第三步：温度95℃时间15s不采集荧光，温度60℃时间35s不采集荧光，温度72℃时间20s不采集荧光；循环数10；

第四步：温度95℃时间15s不采集荧光，温度60℃时间35s采集荧光，温度72℃时间20s不采集荧光；循环数35。