[发明专利]一种特异性鉴别和尚菱的RAPD-SCAR标记及其鉴别方法

权利要求书

1. 能够在和尚菱中扩增到的特异性DNA片段，其特征在于，该片段的核苷酸序列如SEQID NO: 2所示。

2. 针对权利要求1所述的特异性DNA片段设计的SCAR引物，其特征在于，该SCAR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4所示。

3.权利要求1所述的特异性DNA片段在鉴别欧菱品种和尚菱中的应用。

4.权利要求2所述的引物在鉴别欧菱品种和尚菱中的应用。

5.权利要求2所述的引物在制备鉴别和尚菱的试剂中的应用。

6.一种和尚菱的分子鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）采用RAPD引物对由菱品种构建的DNA个体混合池进行PCR扩增，筛选出一条能够在和尚菱中扩增出特异性DNA片段的引物，该引物序列如SEQ ID NO：1所示；

（2）将步骤（1）中的特异性片段进行切胶回收并测序，测得和尚菱中特异性片段的序列如SEQ ID NO: 2所示；

（3）针对特异性DNA片段SEQ ID NO: 2设计SCAR引物，SCAR引物序列如SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4所示；

（4）利用步骤（3）所述的引物，对待测菱品种的基因组DNA进行常规的PCR扩增；

（5）通过琼脂糖凝胶电泳对步骤（4）扩增产物进行检测，鉴定电泳结果中是否出现318bp特异性DNA片段的位置条带，若出现该条带，则表明待测菱品种为和尚菱；若不出现该条带，则表明待测菱品种不是和尚菱。

7. 根据权利要求6所述的分子鉴别方法，其特征在于，所述步骤（4）中进行PCR扩增的反应体系为20 µL，其组分及终浓度为：DNA模板（20 ng/µL）1.0 µL，2×Reaction Mix（含20mM Tris-HCl，100 mM KCl，3 mM MgCl₂，400 µM的dNTPs，溴酚蓝）10.0 µL，引物（10 mM）各0.8 µL，Taq DNA 聚合酶（2.5U/µL）0.4 µL，最后用双蒸水补齐至20 µL；

扩增程序为：94℃，5 min预变性；94℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸45 s，30个循环；最后72℃延伸8 min。

8. 根据权利要求6所述的分子鉴别方法，其特征在于，所述步骤（5）中PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭EB染色，电压100 V，电泳0.5 h后用凝胶成像系统观察、拍照，用2000 bp的DNA marker作为分子量标记。