[发明专利]一株内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一株内切葡聚糖酶和β‑葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉基因工程菌，命名为里氏木霉(Trichoderma reesei)QMEB5，该菌株基因型为QM9414ΔEegl2ΔEbgl1，是以里氏木霉QM9414为出发菌，转化含内切葡聚糖酶2的基因表达盒的融合基因表达载体pTeg2，再转化含有β‑葡萄糖苷酶基因表达盒的质粒pTHB后筛选、验证获得。本发明还公开了所述工程菌株在发酵生产纤维素酶中的应用，实验证实该工程菌株的egl2的表达量较出发菌株提高了27倍，而bgl1的表达量则提高了410倍，内切葡聚糖酶和β‑葡萄糖甘酶活力分别为117.5IU/mL和34.5IU/mL。其发酵生产纤维素酶系可以高效应用于玉米芯以及其他木质纤维素酶材料的降解，具有良好的工业开发和应用前景。

技术领域

本发明涉及一株内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉基因工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

生物质是地球上储量最为丰富的可再生资源。将复杂的生物质酶促水解成可发酵糖进而转化为生物燃料和化学品已成为克服能源危机的有效途径。但是，过高的纤维素酶用酶成本制约了纤维素能源的工业大规模生产。纤维素酶生产效率低、酶的比活力不强及酶组分比例不适合等问题是酶成本过高的主要因素。因此，为了解决该瓶颈问题，一方面需要从菌株本身角度考虑，提高菌株的纤维素酶生产能力；另一方面需要结合基因工程策略优化纤维素酶系的组成以增加其催化效率。

将纤维素转化为可发酵糖的过程需要多种酶组分的参与。这些酶包括外切葡聚糖酶(CBHs)，内切葡聚糖酶(EGs)和β-葡萄糖苷酶(BGLs)。CBHs沿纤维素链滑动，并从纤维素链的两端切除纤维二糖；而EG在纤维素链内随机水解糖苷键，生成纤维寡糖；随后，BGL将产生寡糖和纤维二糖转化为葡萄糖；三者协同水解纤维素。各种酶组分之间的协同效应使得纤维素酶系的酶活力远高于单组分酶的总活力。单个酶的性质以及在酶系中所占的比例影响了纤维素酶系的催化效率。通过调整纤维素酶系中单酶组分的比例已成为优化纤维素酶系的重要策略。基于主要酶组分的复配纤维素酶系已经显示出在各种纤维素底物的水解中接近甚至超过商业纤维素酶的性能。例如，仅用三种主要纤维素酶(CBH1，CBH2和EG1)体外复配的最小酶系可以达到用商业酶制剂获得的纤维素水解率的80.0％。然而，单个纯化的酶组分制备是繁琐且昂贵的，因此阻碍了体外优化的工业应用。因此，利用基因工程策略体内设计和优化纤维素酶系具有重要工业应用价值和理论指导意义。

丝状真菌里氏木霉是目前商业纤维素酶制剂得主要生产菌株(Trichodermareesei)，且能够分泌木质纤维素完全水解所必需的所有核心酶。这些降解酶包括两个CBHs(CBH1和CBH2)、至少四个EGs(EG1，EG2，EG3和EG5)以及BGL1，它们以协同方式起作用以降解纤维素材料。EG1和EG2是里氏木霉两种主要的内切酶，EG的蛋白量占分泌蛋白总量的20％。虽然EG2的比活力是EG1的两倍，但其蛋白分泌量要远低于EG1。因此，EG2是重要的纤维素酶优化靶点。另外，长期以来一直认为BGL不足导致纤维素水解过程中纤维二糖的积累，从而抑制了外切酶的活力，进而导致整个纤维酶系催化效率的降低。因此，BGL1是另一个重要的改造靶点。尽管通过增加单一酶组分比例能够适度的改良纤维素系。然而，仅增加单组分比例并不能达到最优的纤维素酶的催化效率，因此，需要对多酶组分进行复配和设计。迄今为止，国内外尚无利用基因工程优化里氏木霉内源多酶组分以提高纤维素酶系催化效率的报道，更未见有关内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉基因工程菌及其构建方法与应用的报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一株内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶双高分泌的里氏木霉基因工程菌及其构建方法与应用。