[发明专利]从肿瘤样品中分离单细胞的方法在审
| 申请号： | 201811594160.8 | 申请日： | 2018-12-25 |
| 公开（公告）号： | CN109666644A | 公开（公告）日： | 2019-04-23 |
| 发明（设计）人： | 吴文铭;彭俊雅;陈澔;黄丹;刘路路;洪夏飞;丛林;李冬晶;赵玉沛 | 申请（专利权）人： | 中国医学科学院北京协和医院 |
| 主分类号： | C12N5/09 | 分类号： | C12N5/09 |
| 代理公司： | 北京润平知识产权代理有限公司 11283 | 代理人： | 刘依云;王崇 |
| 地址： | 100730 *** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 肿瘤样品 脱氧核糖核酸酶 胰蛋白酶抑制剂 中性蛋白酶 胰腺组织 胶原酶 消化液 收率 单细胞分离 酶活力单位 消化 | ||
1.一种从肿瘤样品中分离单细胞的方法，其特征在于，该方法包括：将肿瘤样品与消化液混合进行消化，所述消化液含有VIII型胶原酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶抑制剂和脱氧核糖核酸酶，其中，所述VIII型胶原酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶抑制剂和脱氧核糖核酸酶的酶活力单位之间的比值为10-1250:0.1-20:500-100000:1，优选为50-625:0.5-10:2000-50000:1。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述中性蛋白酶为Dispase II；
和/或，所述脱氧核糖核酸酶为DNaseI。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，相对于每毫克的VIII型胶原酶，所述消化液中的溶剂的含量为0.1-12.5mL。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述溶剂为含有4-10体积％胎牛血清的磷酸盐缓冲液。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，相对于体积为1cm3的肿瘤样品，所述消化液的用量为20-45mL。
6.根据权利要求1或5所述的方法，其中，所述肿瘤样品的体积是1-2cm×1-2cm×0.5-2cm。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述消化的条件包括：温度为35-38℃，时间为5-80min，振动速率为40-60rpm/min。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括：在消化前，于组织保存液中去除肿瘤样品的纤维、脂肪和坏死组织。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述组织保存液为含有胎牛血清和蛋白酶抑制剂的无血清细胞冻存培养基。
10.根据权利要求1、8或9所述的方法，其中，所述方法还包括：将消化后的样品与红细胞裂解液接触从而裂解红细胞，洗涤后获得分离的单细胞。
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