[发明专利]一种同时检测多种肠道病毒的方法

说明书

本发明公开了一种同时检测多种肠道病毒的方法，属于生物检测领域。本发明针对肠道病毒通用型、柯萨奇病毒A组4型、A组6、A组10、A组16型、肠道病毒71型的靶基因各设计一对特异性引物Fs、Rs以及通用引物Fg、Rg；先采用带有通用引物标签的特异性引物Fg+Fs、Rg+Rs进行富集扩增；然后采用通用引物标签Fg、Rg进行指数扩增；采集指数扩增产物的荧光信号进行检测。本发明方法可以一次性鉴定肠道病毒通用型、柯萨奇病毒A组4、6、10、16型，肠道病毒71型6种肠道病毒病原体，该方法特异性强，灵敏度高，有利于实现手足口病的早发现、早诊断和早治疗，同时显著提升手足口病疫情的应急处置及防控能力。

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别涉及一种同时检测多种肠道病毒的方法。

背景技术

手足口病(hand-foot-mouth disease，HFMD)又名发疹性口腔炎，是由肠道病毒感染引起的，临床表现以发热和手、足、口腔等部位出现皮疹或疱疹为主要特征的一种急性常见传染病。儿童多发，3岁及3岁以下婴幼儿更容易得病。HFMD传染性强，传播途径复杂，传播快，在短时间内即可造成大流行。引起HFMD的病原体主要为肠道病毒属的柯萨奇病毒(Coxsackie virus)A组的2、4、5、7、9、10、16型，柯萨奇病毒B组的1、2、3、4、5型；部分埃可病毒(ECHO-viruses)、肠道病毒71型。其中较为常见的为柯萨奇病毒A组4、6、10、16型，肠道病毒71型。

手足口病病原体型别众多，在这类病原体进行鉴别检测时，普通PCR技术通常每次只能扩增一个靶基因，检测一种病原体，要准确鉴别致病病原体需要进行多次尝试，操作繁复，耗时较长，不能满足社会要求。多重PCR技术可以在一个反应体系中扩增多个靶基因，一次检测多种病原体，提高了检测效率，缩短了检测时间。但是传统的多重PCR技术用多对引物同时扩增多条靶序列是有困难的，因为每条不同的靶序列都具有各自的最佳扩增条件，很难将其统一，即便统一，每条靶序列也存在扩增效率不同，从而导致低浓度/滴度病原体不被扩增，不被检测，而出现假阴性结果。此外，经标记的引物在高浓度使用时容易产生二聚体，从而在扩增结果中造成高的背景。

因此迫切需要建立一种真正高效的手足口病病毒的多重PCR检测方法用于手足口病病毒的快速鉴别检测。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种同时检测多种肠道病毒的方法，本发明方法可同时检测多种肠道病毒—肠道病毒通用型、柯萨奇病毒A组4型、A组6、A组10、A组16型、肠道病毒71型。

本发明的技术方案为：

一种同时检测多种肠道病毒的方法，针对肠道病毒通用型、柯萨奇病毒A组4型、A组6、A组10、A组16型、肠道病毒71型的靶基因各设计一对特异性引物Fs、Rs以及通用引物Fg、Rg；先采用带有通用引物标签的特异性引物Fg+Fs、Rg+Rs进行富集扩增；然后采用通用引物标签Fg、Rg进行指数扩增，指数扩增时加入肠道病毒通用型、柯萨奇病毒A组4型、A组6、A组10、A组16型、肠道病毒71型的带有荧光标记的检测探针；采集指数扩增产物的荧光信号进行检测。

分别针对肠道病毒通用型、柯萨奇病毒A组4、6、10、16型，肠道病毒71型设计一对特异性引物Fs、Rs、一条探针以及一对通用引物Fg、Rg。

表1检测病原体列表