[发明专利]农杆菌介导水稻遗传转化筛选培养基及其应用

说明书

本申请公开了一种农杆菌介导水稻遗传转化筛选培养基，包括基础培养基和筛选抗生素，所述基础培养基原料进一步包括：N6大量元素、MS微量元素、B5有机元素、铁盐、肌醇、脯氨酸、水解酪蛋白、谷氨酰胺、蔗糖、植物凝胶、2，4‑D、6‑BA、蒸馏水；所述筛选抗生素包括下列组份的一种或多种：潮霉素、特美汀、氧氟沙星。本发明通过选择各个基础培养基原料，探索筛选抗生素的类型和浓度、抑菌抗生素的类型和浓度，研制出一种农杆菌介导水稻遗传转化所用的筛选培养基。

技术领域

本发明涉及分子生物学转基因水稻遗传育种技术领域，特别涉及一种外源基因转化水稻时所用筛选培养基及其应用。

背景技术

转基因技术就是将外源基因通过生物、物理或化学手段导入其他生物基因组，以获得外源基因稳定遗传和表达的遗传改良体。

水稻转基因技术始于原生质体培养，1985年首次成功地从水稻原生质体再生完整植株；1988年在粳稻品种中获得第一批转基因水稻植株；1990年从籼稻品种ChinsurahBoro II中获得第一例转基因籼稻植株；1990年李宝健等用农杆菌感染水稻组织获得转化愈伤组织；1991年利用水稻幼胚作为受体材料，用基因枪法，成功获得转基因植株，并且转化效率明显提高。从此，幼胚作为转基因受体材料得到广泛研究应用。

1993年用农杆菌法在粳稻品种上获得了转基因植株，此后，基因枪轰击法和农杆菌介导法作为最有价值的转化途径广泛用于水稻转基因研究。

基因枪法是20世纪80年代末逐步发展起来的，其原理是将外源DNA包在微小的金粒或钨粒表面，再通过高压将微粒高速地射入受体细胞或组织。微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到植物染色体上得以表达，从而实现基因的转化。

自1989年首先用基因枪转化玉米获得转基因植株以来，在水稻、小麦、高粱、大麦、燕麦等重要禾谷类作物中相继成功。基因枪法是基因直接转化的方法之一，具有操作简便，受体材料广泛等优点，但成本较高，转化频率较低。

农杆菌介导法是将外源基因插入农杆菌的质粒上，由载体将外源基因转移并整合到植物细胞基因组中去。基本程序包括：受体系统的建立、转化载体的构建和目的基因的转化三个方面。

利用土壤农杆菌转化水稻，转基因水稻植株的再生频率可高达10％～30％。该转化系统利用天然的转化载体系统，成功率高，遗传稳定性好，可以连接不同的启动子，使外源基因在不同组织里特意表达，且载体可容纳大片段的异源DNA，所以该方法是目前最常用的转基因方法。

PEG转化法是禾谷类作物转化方法中最早应用的方法之一，其主要原理是利用化合物聚乙二醇(PEG)及高pH条件诱导原生质体体外摄取外源DNA。原生质体作为受体具有群体数大，便于操作，DNA分子易进入，获得纯合性的转化子等优点，但原生质体培养难度大、再生频率低、周期长、不适合水稻转化研究。

电击法也是以原生质体为受体的转化方法。其原理是利用短暂的电场脉冲作用，使原生质体膜形成可逆的瞬间通道，使DNA进入细胞。其转化效率高于PEG法，但目前很少应用。

花粉管通道法，其基本原理是利用植物授粉后一段时间内，从珠孔到珠心之间有一条花粉管通道，外源基因可通过此管道进入到胚囊并转化尚不具备正常壁的卵、合子或早期胚胎细胞，进而借助于天然的种胚系统形成转基因种胚。该方法简单、快速、易被人接受，但机理尚不完全清楚，目前应用并不是很多。

在植物基因工程研究中，快速、有效地从大量转化群体(包括愈伤组织和种子等)筛选到含有外源目的基因的转化体是成功获得转基因植株的关键。单子叶植物的遗传转化在育种上具有广阔的应用前景。

目前在高等植物中应用的筛选标记有抗生素类、除草剂类、氨基酸类等等。为获得稳定遗传转化的水稻，需选用水稻较为敏感的筛选标记，来抑制未转化细胞的生长，使携带有筛选标记基因的转化细胞在生长竞争中处于优势，以获得所需要的转化植株。

发明内容