[发明专利]一种乙酰胆碱受体簇集稳定表达的细胞模型及应用方法

说明书

本发明属于细胞模型领域，公开了一种利用慢病毒感染构建稳定表达乙酰胆碱受体簇集(clustered‑AchR)的细胞模型及应用方法，所述乙酰胆碱受体簇集稳定表达的细胞模型的构建方法包括：慢病毒构建、稳定表达AChR的细胞株的构建与筛选；所述乙酰胆碱受体簇集稳定表达的细胞模型的应用方法包括结合免疫荧光技术、流式细胞技术和Biacore SPR技术检测抗体表达；本发明通过采用慢病毒感染细胞的方法，通过Rapsyn蛋白使该细胞表面能够稳定表达乙酰胆碱受体蛋白簇集，从而构建乙酰胆碱受体簇集稳定表达的细胞模型，结合抗原抗体检测免疫荧光技术、流式细胞技术和Biacore SPR技术检测血清乙酰胆碱受体抗体，从而提高抗体阳性检测率。

技术领域

本发明属于细胞模型技术领域，尤其涉及一种乙酰胆碱受体簇集稳定表达的细胞模型及应用方法。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：

重症肌无力(Myasthenia gravis，MG)是一种由自身抗体所介导的横纹肌神经-肌肉接头处神经递质信号传递障碍的自身免疫性疾病，发病机制与抗乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor antibody，AchR)抗体密切相关，其发病年龄广、致残率高、易复发、预后差等特点严重威胁人类的健康。

到日前为止，国内外有关AchR抗体的检测方法主要有放射免疫沉淀试验、酶联免疫吸附法(ELISA法)及免疫荧光测量法。1)放射免疫沉淀法：灵敏度较高，但有部分患者血清中难以查到抗体，该方法仅利用部分乙酰胆碱受体作为抗原，无法真实模拟细胞表面簇集的乙酰胆碱受体，因而利用该方法检测，许多重症肌无力患者血清乙酰胆碱受体抗体表现为阴性或低滴度。同时，该方法操作相对复杂，也很难同时进行大量样本的检测。2)ELISA法：ELISA技术是目前国内外临床检测AchR抗体的主要方法之一。该法虽具有方便、快捷、无放射性等特点，但该法依然无法再现人体内细胞表面乙酰胆碱受体抗原抗体反应的微环境，因此利用ELISA法检测，仍然存在部分确诊重症肌无力的患者出现乙酰胆碱受体抗体阴性的情况；而且目前商品化试剂盒多，各公司产品敏感度存在差异，很难实行统一标准,不同厂家和型号的试剂盒验出的结果不具有良好的可比性。3)免疫荧光测量法：主要包括荧光素酶免疫系统法和免疫荧光分析法。与放射免疫沉淀法和ELISA等方法相比，其敏感性相对较差，应用价值更为有限。

当前，由于上述原因，有20％左右的患者采用上述方法不能检测出血清乙酰胆碱受体抗体。因此，建立敏感度高、实验性血清乙酰胆碱受体抗体检测方法是提高重症肌无力诊断的有效途径，也是目前临床迫切需要解决的问题。

综上所述，现有技术存在的问题是：

现有抗体检测技术存在敏感度低的重要缺陷，无法有效地再现人体内细胞表面乙酰胆碱受体抗原抗体反应的微环境，因而不能有效检测出重症肌无力患者血清内的乙酰胆碱受体抗体。另外，国内外采用ELISA法检测抗体时固相载体包被的抗原质量有差异，影响检测结果。包被的抗原浓度要求控制于最适稀释浓度，包被浓度过高则结合的抗体洗脱的概率也越高，而浓度过低则不能达到检测要求。上述多种原因造成目前抗体检测阳性率低，对重症肌无力诊断的准确度较低。

解决上述技术问题的难度和意义：