[发明专利]一种提高异戊二烯产量的基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

一种提高异戊二烯产量的基因工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。为了提高生物法合成异戊二烯的产量，并减少中间产物对菌体的毒性，本发明提供了一种提高异戊二烯产量的基因工程菌；所述基因工程菌过表达含有D18包裹信号肽序列的甲羟戊酸激酶基因ERG12，含有D18包裹信号肽序列的磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、含有D18包裹信号肽序列的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19、含有D18包裹信号肽序列的异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1、含有D18包裹信号肽序列的异戊二烯合成酶的基因IspSsubgt;pa/subgt;、以及含有PduA、PduB、PduJ、PduK、PduN和PduU基因簇的重组质粒，出发菌株为大肠杆菌。所述基因工程菌可用于发酵生产异戊二烯。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种提高异戊二烯产量的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

异戊二烯(isoprene)是一种重要的化工原料和平台化合物，主要用于合成橡胶。此外，它还在精细化工中被用于合成其它异戊二烯类化合物及其衍生物，用途覆盖医药、农药、香料、生物燃料等领域，每年全球的需求量达到上百万吨。目前异戊二烯的生产主要是通过化学法从石油基原料中获得。然而，随着化石资源的日益枯竭和价格的不断攀升，原料问题和环境问题已成为制备异戊二烯的重要瓶颈。因此，寻找异戊二烯新的生产途径是今后异戊二烯工业生产的重要发展趋势。

目前，利用工程微生物如大肠杆菌、酵母等来生产异戊二烯已成为可能。但是生物法合成异戊二烯仍有两方面问题有待解决：一是外源MVA途径较长，且MVA下游途径催化效率低，例如目前MVA途径中间产物甲羟戊酸的产量能达到84g/L，异戊二烯产量仅为理论转化率的28％，且通过筛选新来源的酶或对现有的酶进行定向改造对催化效率的提升也都不明显；二是某些中间产物如异戊烯基焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate,IPP)、二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate,DMAPP)等对菌体具有毒性，影响了菌体的正常生长。

发明内容

为了提高生物法合成异戊二烯的产量，并减少中间产物对菌体的毒性，本发明提供了一种提高异戊二烯产量的基因工程菌；所述基因工程菌过表达含有D18包裹信号肽序列的甲羟戊酸激酶基因ERG12，含有D18包裹信号肽序列的磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、含有D18包裹信号肽序列的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19、含有D18包裹信号肽序列的异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1、含有D18包裹信号肽序列的异戊二烯合成酶的基因IspS_pa、以及含有PduA、PduB、PduJ、PduK、PduN和PduU基因簇的重组质粒，出发菌株为大肠杆菌。

进一步地限定，所述D18包裹信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

更进一步地限定，所述甲羟戊酸激酶基因ERG12，为来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的甲羟戊酸激酶基因ERG12，GeneBank登录号为855248；所述磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8，为源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8，GeneBank登录号为855260；所述甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19，为源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19，GeneBank登录号为100195467；所述异戊烯焦磷酸异构酶基因，为源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1，GeneBank登录号为855986；所述异戊二烯合成酶基因IspS_pa，为源于银白杨(PopμLus alba)的异戊二烯合成酶基因IspS_pa，GeneBank登录号为AB198180，所述含有PduA、PduB、PduJ、PduK、PduN和PduU基因簇的重组质粒为pLysS-PduABJKNU。

本发明还提供了上述基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：