[发明专利]一种利用CRISPR/Cas9+AAV制备通用型CAR-T细胞的方法

说明书

本发明涉及一种利用CRISPR/Cas9+AAV制备通用型CAR‑T细胞的方法，属于免疫细胞治疗领域。本发明利用CRISPR/Cas9+AAV敲除免疫检查点PD‑1、人类白细胞抗原(HLA)以及TCR，多基因敲除制备通用型CAR‑T细胞，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行精确基因敲除，同时与腺相关病毒(AAV)融合运用，代替慢病毒实现精确基因敲入，避免慢病毒随机整合潜在的风险。本发明的方法可以实现多靶点基因敲入和敲除，构建通用型CAR‑T细胞用于异体治疗，解决传统CAR‑T细胞治疗存在的慢病毒随机插入性突变风险、自体CAR‑T的设计及培养制备成本过高、制备周期长，细胞数量及扩增能力不足等问题。

技术领域

本发明涉及一种利用CRISPR/Cas9+AAV制备通用型CAR-T细胞的方法，属于免疫细胞治疗领域。

背景技术

嵌合型抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)是通过基因改造后获得靶抗原单克隆抗体单链可变区(scFv)的T细胞。CAR-T通过抗原抗体结合的原理特异性识别肿瘤细胞表面的抗原，因此无主要组织相容性复合体(MHC)限制性，还可以避免因肿瘤细胞MHC下调或丢失导致的免疫逃逸。而且通过在嵌合基因设计时增加共刺激分子信号，可增强CAR-T细胞的肿瘤杀伤活性。经过20多年的发展，CAR-T的设计已经越来越完善，手段也越来越多。

据统计，国内近几年B淋巴细胞白血病和淋巴瘤的年新发病率约为10万人，绝大多数异常增生的B淋巴细胞表面都表达CD19分子，抗CD19构建的CAR-T对血液系统恶性肿瘤展现出显著疗效，如对晚期复发难治性急性淋巴细胞白血病(ALL)治疗的完全缓解率(CR)可达到90％，对慢性淋巴细胞白血病(CLL)和部分B细胞淋巴瘤的CR达到50％以上。

但目前CAR-T技术普遍存在以下问题：(1)需要更长的时间观察病毒载体是否会带来有害的插入性突变：CAR序列是CAR-T细胞最核心的部件，目前制造CAR-T主要采用的方法是利用慢病毒作为载体将CAR序列随机整合到T细胞基因组中，从而实现外源CAR序列的内源化；但由于慢病毒整合的位点具有随机性，存在一定的随机整合潜在风险，导致转导后T细胞的癌变、随机表达不相关的基因或者是渐渐不表达抗原受体等；(2)CAR-T的设计及培养制备成本过高：由于每个病人的CAR-T都需要个性化制备，治疗费用高达几十万美元，同时也无法采用统一的标准进行质量监控；(3)自体CAR-T的制备需要3-4周的时间，这对于“时间就是生命”的癌症患者来说是非常长的等待期；(4)很多患者在经历了多轮治疗后，自体T细胞活性很差或者扩增能力有限，这直接影响了CAR-T的疗效，甚至有些患者根本无法获得能扩增制备CAR-T的细胞。

腺相关病毒(AAV)的优势：转染效率高，很多细胞都能达到近99％；只作为转染载体，不随机整合，安全性高；一般不需要助转剂，避免助转剂对宿主细胞的损伤。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种利用CRISPR/Cas9+AAV制备通用型CAR-T细胞的方法，该方法不仅可以精确编辑基因序列，提高产品的安全性和可控性，又可实现异体治疗、产业化生产和统一质量控制标准，有效降低治疗时间成本和资金成本，促进CAR-T细胞治疗的运用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种利用CRISPR/Cas9+AAV制备通用型CAR-T细胞的方法，包括以下步骤：

(1)采用磁珠分离获得高纯度的CD3+T细胞，进行活化处理；

(2)利用CRISPR/Cas9技术进行基因编辑，构建CAR表达载体；

(3)用腺相关病毒包装步骤(2)所得的CAR表达载体，扩增，得到携带CAR的腺相关病毒，并侵染T细胞；

(4)T细胞扩增培养，得CAR-T细胞。