[发明专利]一种快速检测犬瘟热病毒抗原的检测卡及其制备方法

权利要求书

1.一种快速检测犬瘟热病毒病原的检测卡，所述检测卡包括依次相连接的吸水垫、基膜、金标垫和样品垫，其特征在于，所述基膜上设置有C线和T线，所述C线上包被有羊抗鼠IgG的抗体，所述金标垫中含有胶体金标记的第一单克隆抗体，所述T线上包被有第二单克隆抗体；所述第一单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO:C2018146的杂交瘤细胞株Cdv 37C7分泌得到，所述第二单克隆抗体由保藏编号为保藏编号为CCTCC NO:C2018147的杂交瘤细胞株Cdv 36D9分泌得到；分泌抗犬瘟热病毒抗体的杂交瘤细胞株Cdv 36D9于2018年6月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2018147，保藏地址为中国武汉-武汉大学；分泌抗犬瘟热病毒抗体的杂交瘤细胞株Cdv 37C7于2018年6月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2018146，保藏地址为中国武汉-武汉大学。

2.权利要求1所述的快速检测犬瘟热病毒病原的检测卡的制备方法，包括以下步骤：

步骤一，抗体制备及纯化：采用动物体内腹水诱生法制备单克隆抗体36D9和37C7；采用SPA柱法对腹水进行纯化，即得抗犬瘟热病毒单克隆抗体36D9和37C7；

步骤二，胶体金溶液的熬制；

步骤三，抗犬瘟热病毒37C7单克隆抗体的标记：每1ml胶体金溶液先加45微升1％K₂CO₃，然后再加入37C7单克隆抗体，按照每1mL胶体金溶液加入6μg抗犬瘟热病毒单克隆抗体37C7，室温下120rpm摇30min，加入10％牛血清白蛋白20μL，室温下120rpm摇30min，12000rpm离心20min，弃上清，用0.01M PBS溶解沉淀，即得到标记好的抗犬瘟热病毒37C7单克隆抗体标记物；

步骤四，金标垫处理及胶体金膜的制备：选择聚脂纤维6613作为金标结合垫；将金标垫浸泡在处理液A中5min，处理液A为0.01M PBS，pH7.4，0.2％Triton X-100，取出37℃烘干，备用；将标记好的抗犬瘟热病毒37C7单克隆抗体标记物用划膜仪以5μL/cm的浓度喷涂在处理好的金标垫上，室温自然晾干或者37℃烘干，制成含有抗犬瘟热病毒37C7单克隆抗体标记物的胶体金膜；

步骤五，样品垫处理：选择DL42为样品垫，将样品垫，浸泡在处理液B中5min，处理液B为0.01M PBS，pH7.4，1％Triton X-100，1％BSA，0.05％NaN₃，取出37℃烘干，备用；

步骤六，C、T线确定：选择Sartorius CN140膜，分别将抗犬瘟热病毒36D9单克隆抗体和羊抗鼠二抗作为T线和C线划在NC膜上，浓度分别为1mg/mL和0.6mg/mL，用划膜仪依次以1μL/cm的浓度喷涂在NC膜上，37℃包被2h后，室温自然晾干或者37℃烘干，制成基膜；

步骤七，检测卡的组装；

所述胶体金溶液的熬制采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，具体步骤为：量取99mL的超纯水装入250mL 的圆底烧瓶，放入搅拌子，置于磁力搅拌器上，加入1％氯金酸溶液1mL，适当速度搅拌，打开加热开关，待溶液沸腾后迅速一次性加入1.6mL1％柠檬酸三钠溶液，氯金酸溶液由灰色逐渐变为酒红色，颜色稳定后继续加热10min，待溶液冷却后，用微孔滤膜过滤，4℃保存备用，紫外扫描得到最大吸收峰为523nm的胶体金颗粒。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述胶体金颗粒大小为25nm。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，胶体金标记的抗犬瘟热病毒37C7单克隆抗体的悬浮保存液配方组成为pH 8.5的0.01MTris缓冲液，内含2％酪蛋白、1％牛血清白蛋白、0.5％聚乙二醇20000、0.1％叠氮钠。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，检测线包被时的缓冲液配方成分为pH8.5的0.01MTris缓冲液，内含10％牛血清白蛋白、0.5％聚乙二醇20000、0.1％叠氮钠；质控线包被时的缓冲液配方成分为pH 8.5的0.01M PBS缓冲液，内含10％牛血清白蛋白、0.5％聚乙二醇20000、0.1％叠氮钠。

6.一种快速检测犬瘟热病毒病原的测试剂盒，其包括权利要求1所述的快速检测犬瘟热病毒病原的检测卡和样本稀释液，所述样本稀释液的配方为0.9％生理盐水溶液，内含5％牛血清白蛋白、0.1％吐温20、0.1％叠氮钠，0.5％丙氨酸。