[发明专利]一种简便准确测定溶液中透明质酸分子量的方法

说明书

本发明公开了一种简便准确测定发酵液及溶液中透明质酸分子量的方法，该方法基于透明质酸溶液或发酵液的特性粘数和糖醛酸含量来测定其中包含的透明质酸的分子量。该方法既简单，又具有较高的准确性和重现性。既可作为透明质酸液体分子量简便准确的检测方法，又为透明质酸生产企业发酵水平检测及生产不同分子量的透明质酸提供操作依据。对提高产品质量及生产效率具有重大的意义，同时也为化妆品和医药领域所需的透明质酸液体提供了直接检测分子量的方法。

技术领域

本发明涉及透明质酸的检测领域，具体涉及一种简便准确测定透明质酸发酵液及溶液中透明质酸的分子量的方法。

背景技术

透明质酸(hyaluronic acid，HA)是由乙酰葡糖胺和葡糖醛酸为双糖单位重复交替连接形成的高分子粘多糖，由于其特殊的生物学特性和生理功能，已被广泛应用于化妆品及医学领域。HA的相对分子质量大小是表征其特性的基本参数之一，HA的生物学性质与其相对分子量大小有密切的关系。不同相对分子量透明质酸，其生理活性也不相同，甚至具有完全相反的作用。例如，分子量大于2 000 000的HA具有较好的保湿性、黏弹性、润滑、抑制炎性反应等功能，可用于眼科手术、骨关节注射制剂；分子量1 000 000～2 000 000的HA具有良好的保湿性、润滑性及药物缓释作用，广泛用于化妆品、滴眼液和皮肤烧伤愈合；分子量10000～80000的HA属低分子，口服能被肠道吸收，补充机体HA的不足，发挥保健和美容养颜的功效；HA寡聚糖(分子量小于10000)具有抗肿瘤、促进骨和血管生成作用，具有潜在的医学应用前景。

目前常用的透明质酸相对分子量测定方法有以下三种：特性粘数(intrinsicviscosity)法、高效凝胶渗透色谱(high performence gel permeation chromatography，HPGPC)法、多角度激光散射仪结合凝胶渗透色谱(multi angle laser light scatteringcombined with gel permeation chromatography，GPC/MALLS)法。

特性粘数法，是利用高分子物质的流变学性质来计算物质的分子量，该方法简单易行，至今被广泛应用。例如，在专利文献1中，利用特性粘数(极限粘度)法测定了分子量为10万以下的低分子透明质酸。在《欧洲药典》7.0版及《英国药典》2013版收载的玻璃酸钠检查项，仍通过特性粘数法对其分子量进行控制。该法不需要对照品，但受样品纯度影响较大，且需要准确得知溶液中透明质酸的含量。特性粘数法由于不需要昂贵的设备，且检测方法简单，结果准确，为最常用的透明质酸分子量测定方法。目前通过此种方法测定透明质酸溶液分子量时，首先将溶液进行乙醇沉淀，并收集沉淀，干燥获得固体后再进行测定，该方法复杂结果的准确性差而且耗时较长。

高效凝胶渗透色谱法(HPGPC法)，是根据分子大小进行分离的一种液相色谱技术，物质通过色谱柱的保留时间与其分子量的对数呈线性负相关。该法重现性好，速度快，能测得平均分子量及其分布。然而HPGPC法测定分子量需要相应的对照品进行校正，而透明质酸对照品一般很难得到，因此只能选择结构相似的样品作为对照品，对照品结构不同，测得分子量不同，这使得测得的样品分子量与真值有一定偏差。

多角度激光散射仪结合凝胶渗透色谱法(GPC/MALLS法)，对任何分子量范围的高分子样品，无论其在流动相中分子状态如何，都可获得样品洗脱图中每一级分点的浓度和分子量。该法不需要对照品即可获得样品的分子量，测定结果准确可靠。但是该仪器价格昂贵，并且在超高分子量测定时，样品可能会在具孔介质中发生剪切降解，并且也可能阻塞凝胶柱。因此，本方法的应用受到限制。

非专利文献1中提到，在测定分子量范围介于10KDa～100KDa内的透明质酸时，特性粘数法与GPC/MALLS法测得的分子量值基本相同，而HPGPC法测得的值与其它两种方法测得值差异较大。