[发明专利]细胞保存液、保存方法及其应用

说明书

本发明提供了一种细胞保存液、保存方法及其应用。该细胞保存液包括DMEM高糖培养基、抗生素及HEPES液。本申请通过摈弃了容易改变细胞结构的细胞固定液成分和无法满足CO₂浓度需求的pH缓冲剂，而选择包含上述成分的细胞保存液，在为细胞提供生长和存活所需要的盐离子和氨基酸等成分，尽最大可能的为细胞提供适宜的生长和生存环境的同时，还为细胞提供了稳定的pH值和抵抗污染的能力，进而不仅最大限度地维持细胞的活性使细胞处于正常的形态，而且保证了经过较长时间后，细胞仍然能保持活性以满足后续实验的要求。

技术领域

本发明涉及细胞保存与运输领域，具体而言，涉及一种细胞保存液、保存方法及其应用。

背景技术

细胞是生命科学研究中的重要对象，由于其对温度、环境的要求较高，因此活细胞一直无法进行长时间和长距离的运输，这对于研究的开展具有不利影响。细胞运输方式，现有的困难主要有两点：1)非冻结运输。易发生培养液涌动，导致细胞发生机械损伤。为了避免培养液涌动，需把培养瓶灌满培养液，才能安全运输，而这样成本就会增加。2)冻结运输。可维持细胞稳定性，但复苏过程中会引起细胞活性损失、时间损耗、增加人工费用和试剂等成本，尤其是当取得的样本为新鲜细胞时，细胞的保存及运输对于运输后细胞的活性和试验结果具有决定性的作用。

能保证细胞活性的细胞保存与运输方法，对于无创产前筛查同样具有划时代的意义。据《中国出生缺陷防治报告(2012)》统计，我国出生缺陷总发生率约为5.6％。出生缺陷与染色体畸变、基因突变等遗传因素密切相关，包括染色体数目或结构异常的染色体病，染色体微缺失微重复以及由一对等位基因控制的单基因遗传病等，为孕妇的产前筛查和诊断为出生缺陷的干预和治疗提供重要依据。

孕早期是产前检测或诊断的最佳时期，尤其对生育过遗传病患儿的孕妇，早期筛查和诊断能有效缓解孕妇的焦虑情绪。传统的产前诊断技术如羊膜腔穿侧、绒毛膜活检和脐带穿刺等利用胎儿的完整基因组进行遗传检测，结果准确可靠，但是侵入性操作有流产和感染风险。随着技术的发展，基于胎儿游离核酸的无创产前技术(NIPT)逐渐受到大众的认可，并得到广泛应用。但是NIPT检测虽然安全准确，但是仍然存在一定的局限性。影响NIPT准确性的主要因素是胎儿游离合算的浓度，但孕早期胎儿游离核酸浓度很低，大约在30-32周才能达到峰值，同时母体的健康水平也会影响胎儿游离核酸的浓度，而低浓度可能会造成假阴性或者假阳性结果。此外对于检测小于1M的微缺失微重复和拷贝数变异以及单基因位点的突变等变异具有较大的难度。

与胎儿游离核酸来源相同的绒毛膜滋养层细胞，在孕妇宫颈管内有一定的数量，通过宫颈刷刷取的方式即可获得。医院在对孕妇进行产检时，会将宫颈刷刷取到的细胞置于新柏氏液内进行固定，固定后的细胞会在一定时期内保持其形态结构不变，方便医院对孕妇样本进行涂片检测。但是固定后的细胞在六个小时内会彻底失去细胞活性。无活性的细胞无法进行后续的磁珠筛选等操作，且有限的保存时间不利于商业样本的保存，为长距离或者异地运输带来困难。

此外，细胞本身较为脆弱，其活性会受到各种因素的影响。已有的细胞保存液产品中，由于无法避免外界环境中温度变化对细胞造成的损伤，因此对于运输条件的要求较高，在较高或较低温度下运输后，细胞活性难易满足实验的需求。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种细胞保存液、保存方法及其应用，以解决细胞难以长时间保存的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种细胞保存液，该细胞保存液包括DMEM高糖培养基、抗生素及HEPES液。

进一步地，抗生素包括青霉素和/或链霉素。

进一步地，细胞保存液中，青霉素的终浓度为80～120U/ml，优选为100U/ml；链霉素的终浓度为0.05～0.15mg/ml，优选为0.1mg/ml。

进一步地，细胞保存液中，DEME高糖培养基与HEPES液的体积比为：10:5～10:20。