[发明专利]一种高产杆状病毒表达载体

说明书

本发明公开了一种基因敲除型高产杆状病毒表达载体。该载体通过同时敲除两个相邻的杆状病毒非必需基因Ac15和Ac16，使外源蛋白表达水平提高至少60%。同时，病毒的增殖特性也显著改善。表达产量的提高能显著降低企业的生产成本。该杆状病毒表达载体可用于生物制品工业领域，特别是亚单位疫苗工业领域。

技术领域

本发明属于重组蛋白质表达技术领域，尤其涉及一种基因敲除的高产杆状病毒表达载体。

背景技术

杆状病毒是特异感染节肢动物的双链DNA病毒，苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒（Autographa californica nucleopolyhedrovirus, AcMNPV）是杆状病毒的模式种。自从1983年Smith GE等首次用杆状病毒在昆虫细胞中表达人β-干扰素基因以来（Mol CellBiol. 1983; 3:2156-65.），由于具有低成本、高产量，而且具备各种翻译后修饰系统等优点，杆状病毒表达载体系统在科研和生产中被广泛应用。

但相较于工业上普遍使用的原核表达系统（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌）和酵母表达系统，杆状病毒表达载体系统的产量还不尽人意。为此人们采取了多种策略提高该表达系统的产量，这些策略包括：

1、改造启动子及周边元件。比如通过串联p6.9和p10启动子可以将GFP产量提高4.4倍（PLoS ONE. 2014; 9(5): e96562.）；在polh启动子下游重复一次Burst sequence可以使GUS酶活提高1.5倍（Biotechnol Bioeng. 2010; 107:909-16.）。

2、构建抗凋亡载体或细胞系。中国台湾一个课题组用RNA干扰载体在昆虫细胞Sf9中表达Sf-caspase-1的dsRNA，成功沉默了细胞中的Sf-caspase-1，使外源蛋白的产量显著提高（Biotechnol Appl Biochem. 2007; 48: 11-19.）。张潇月等将靶向Sf-caspase-1的双链小RNA编码序列直接克隆到杆状病毒基因组上，使表达的荧光素酶活性提高10倍（BMCBiotechnol. 2018; 18:24.）。

3、敲除非必需基因。比如敲除几丁质酶和组织蛋白酶（ChiA/Cath）有助于提高分泌蛋白的表达（J Virol Methods. 2004; 122:113-118.）；在此基础上再敲除三个连续的非必需基因p26、p10、p74，可以使EGFP的产量增加2.6倍（Cell Biol Toxicol. 2010; 26:57-68.）。

敲除非必需基因提高外源基因产量的机制是多样的。敲除组织蛋白酶（Cath）基因可以降低蛋白质的降解；敲除p10可以降低释放感染晚期的细胞内转录资源。此外，敲除非必需基因也可以减小杆状病毒基因组的大小，有利于容纳更大的外源DNA片段。

我们通过检索文献，发现杆状病毒基因组中存在大量非必需基因，并且一些非必需基因彼此相邻成簇存在，这些成簇存在的非必需基因包括Ac15和Ac16。

Ac15编码蜕皮类固醇UDP-葡萄糖基转移酶（EGT）。EGT的功能是通过催化葡萄糖从UDP-葡萄糖转移到蜕皮类固醇，来阻止受感染幼虫的蜕皮和化蛹。EGT的存在可以延长感染幼虫的摄食阶段，从而使病毒能够在更大的幼虫中长时间复制，进而导致更高的病毒产量。研究发现，EGT基因失活的AcMNPV和BmNPV（Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus）突变体是可以感染和复制的（J. Virol. 1990; 64:1321-1328.），但昆虫的存活时间明显缩短（Bio/Technology. 1991; 9:1086-1089.）。用细胞系增值的杆状病毒经常可以分离到EGT基因的自发缺失突变体（Virus Res. 1987; 7:335–349.）。