[发明专利]一种用于制备R型去氧肾上腺素的酮还原酶突变体

说明书

本发明涉及一种用于制备R型去氧肾上腺素的酮还原酶突变体，属于蛋白质工程技术领域。通过蛋白质工程对酮还原酶进行饱和突变，构建出突变体文库，并对该文库进行筛选，得到了在催化α‑氯代‑3‑羟基苯乙酮转化为(R)‑2‑氯‑1‑(3‑羟基苯基)乙醇中间体过程中，手性选择性提高的酮还原酶突变体，中间体ee值由突变模板酶的98.5％提高至99.8％，可以不需提纯直接用于后续化学反应，直接制备R型去氧肾上腺素，工艺得到了进一步简化，降低了生产成本，适合工业化生产。

技术领域

本发明属于蛋白质工程技术领域，具体涉及一种用于制备R型去氧肾上腺素的酮还原酶突变体。

背景技术

去氧肾上腺素(phenylephrine，PE)，又名苯肾上腺素，是一种α1受体激动药物，具有血管收缩作用。去氧肾上腺素由于侧链存在手性碳原子而存在异构体，分为R型去氧肾上腺素和S型去氧肾上腺素，其中R型异构体的受体激动作用远强于S型异构体。

在临床中，广泛应用于阵发性室上性心动过速、在休克及麻醉时用于维持血压、在眼科检查中可作为安全的短效扩瞳药使用，作为伪麻黄碱最简单有效的替代品，R型去氧肾上腺素在非处方感冒药中的使用也呈现增长趋势。

R型去氧肾上腺素最初是通过化学法进行手性拆分来制得的，后来随着合成工艺的改进，开始采用不对称氢化方法制备R型去氧肾上腺素。

鉴于生物酶具有独特的催化专一性，反应温和等优点，越来越多的研究学者采用生物法手性拆分R型去氧肾上腺素。

专利US8617854公开报道一种采用酶催化技术改进R型去氧肾上腺素的制备工艺。他们使用固氮弧菌属物种EBN1的醇脱氢酶催化合成R型去氧肾上腺素的中间体(R)-2-氯-1-(3-羟基苯基)乙醇，底物浓度<50mM(8.5g/L)，ee值未见报道。该路线使用了醇脱氢酶(EC1.1.1.1)作为生物催化剂，且在两相液体反应介质中进行。由于在两相反应体系中，反应产物与水分离，不利于使反应液直接参与下一步的甲胺化反应，增加了操作成本。

因此，目前急需一种能够在单相体系中，具有高催化效率、高手性选择性地还原α-氯代-3-羟基苯乙酮为(R)-2-氯-1-(3-羟基苯基)乙醇的酮还原酶，以此简化和改进R型去氧肾上腺素的合成工艺，提高原料药R型去氧肾上腺素的生产效率。

发明内容

为了克服现有技术存在的上述缺陷，本发明提供一种用于制备R型去氧肾上腺素的酮还原酶突变体。

一方面，本发明提供的酮还原酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO.2所编码的氨基酸序列发生突变的氨基酸序列，所述发生突变的氨基酸序列的突变位点为第199位的天冬酸突变为亮氨酸。

进一步，所述酮还原酶突变体氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

进一步，酮还原酶表达于基因工程菌，如大肠杆菌或酵母菌。

进一步，所述酮还原酶用于制备R型去氧肾上腺素，见Scheme 1。

更进一步，α-氯代-3-羟基苯乙酮在酮还原酶催化作用下，转化为(R)-2-氯-1-(3-羟基苯基)乙醇，产物ee值可达99.8％。

进一步，基因编码权利要求1所述的酮还原酶突变体。

进一步，所述的基因核苷酸序列为SEQ ID NO.3。