[发明专利]产抑藻活性物质的芽孢杆菌及用途

权利要求书

1.产抑藻活性物质的芽孢杆菌在发酵生产抑藻活性物质中的用途，所述产抑藻活性物质的芽孢杆菌为芽孢杆菌（Bacillus sp.）dhs-330，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：M 2018846；

其发酵生产抑藻活性物质中的用途，包括以下步骤：

（1）菌种制备

在无菌环境下，将-80℃保存的菌株dhs-330接种于固体培养基平板，30 ℃培养箱静置培养36 h；

所述固体平板培养基配方：葡萄糖32 g/L，尿素5.0 g/L，酵母提取物1.2 g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 3.0 g/L，KH₂PO₄ 0.8 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L，微量元素溶液2.0 mL，琼脂20 g/L，pH 7.0，115 ℃灭菌30 min；所述葡萄糖单独灭菌；所述微量元素溶液的组分为：CaCl₂ 7.5 g/L，FeSO₄·7H₂O 2.0 g/L，MnSO₄·H₂O 2.0 g/L；

（2）二级种子液制备

无菌环境下挑取dhs-330菌株，转接到液体培养基中，摇床培养，条件为温度30 ℃，摇床转速160 rpm，培养时间36 h，获得一级种子液；无菌环境下吸取获得的一级种子液，接种到液体培养基，接种量2%，摇床培养，条件为温度30 ℃，摇床转速160 rpm，培养时间36 h，得到二级种子液；

所述液体培养基配方为：葡萄糖33 g/L，尿素5.0 g/L，酵母提取物1.2 g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 3.0 g/L，KH₂PO₄ 0.8 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L，微量元素溶液2.0 mL，pH 7.0，115℃灭菌30 min；所述葡萄糖单独灭菌；所述微量元素溶液的组分为：CaCl₂ 7.5 g/L，FeSO₄·7H₂O 2.0 g/L，MnSO₄·H₂O 2.0 g/L；

（3）发酵培养基的配制

配制50 L发酵培养基的配方：葡萄糖2.0 kg，尿素300 g，酵母提取物75 g，Na₂HPO₄·12H₂O 200 g，KH₂PO₄ 45 g，MgSO₄·7H₂O 15 g，CaCl₂ 1.125 g，FeSO₄·7H₂O 0.3 g，MnSO₄·H₂O 0.3 g，调节pH至7.0，泵入发酵罐中，设置灭菌温度121 ℃，灭菌20 min；

（4）发酵罐培养

灭菌程序结束后，设置发酵罐温度30℃，pH 7.0±0.5，罐内压力3 PSI，溶氧40%，由搅拌转速和通气量关联，调到自动模式，搅拌转速控制范围为100 rpm~500 rpm，通气量范围10 SLPM~60 SLPM，待发酵罐温度、溶氧、pH稳定后，导入二级种子液，接种量2%，培养3 d后下罐，将发酵液导出，即获得含有抑藻活性物质的发酵液；

（5）抑藻活性物质的分离纯化

获得的发酵液用10000 rpm，离心15 min去除菌体，获得的上清液用6M的盐酸调节pH至2.0，室温静置过夜，酸化液10000 rpm，离心20min，舍弃上清得到沉淀，设置烘箱温度40 ℃烘干，得到粗产物；粗产物用5 L氯仿/甲醇复溶，所述氯仿/甲醇的体积比=5/3，10000 rpm离心10 min，上清液在60 ℃下旋蒸去除有机溶剂，得到抑藻活性物质。