[发明专利]一种鉴定蒙古扁桃的方法

说明书

本发明提供一种用于鉴定样本是否属于蒙古扁桃的方法，所述方法包括以下步骤：(1)从所述样本中提取基因组总DNA；(2)以步骤(1)中提取的DNA为模板，使用用于扩增ITS序列的特异性引物对进行PCR扩增；(3)对PCR产物进行测序；(4)将测序结果与一种或多种已知蒙古扁桃物种的ITS序列进行序列比对；以及(5)根据序列比对结果鉴定样本是否属于蒙古扁桃。本发明还提供相关的用途和试剂盒。

技术领域

本发明涉及植物物种鉴定领域，具体涉及一种鉴定植物样品是否属于蒙古扁桃的方法，特别涉及一种利用ITS序列鉴定蒙古扁桃的方法。

技术背景

蒙古扁桃(Prunus mongolica maxim)为蔷薇科旱生灌木^[1]，其主要分布在中国西北部和蒙古南部海拔900-2400m的丘陵、坡麓、石质坡地及干河床等地^[2]。蒙古扁桃是重要的木本油料树种之一，其种仁含油率约为40％，油可供食用，种仁可入药。成熟果实的种仁具润肠通便、止咳化痰功效，主治咽喉干燥、干咳及支气管炎、阴虚便秘、腹水、脚气、水肿等病症。近年来，由于分布区自然生态环境的恶化和周边农牧民的过度樵采、放牧，野生蒙古扁桃数量锐减，分布范围急剧缩小，使该珍贵植物资源处于濒危灭绝的边缘^[3]。建立蒙古扁桃快速鉴定手段，可准确的发现并保护蒙古扁桃天然居群，有利于其种质资源的保护。

DNA条形码是利用标准的基因片段对物种进行快速鉴定的技术，已经成功用于生物物种分类和鉴定、生态学、分子系统发育与进化和生物多样性评估等研究领域，为现代生物学研究提供了丰富的分子信息和标准的数据平台，为植物遗传多样性检测提供了更直接、更精确的方法，即直接检测序列本身的变化，目前成为了最有效的遗传学分析方法^[4-5]。ITS序列位于高等植物中核糖体的rRNA基因(rDNA)。rDNA是高度重复的串联序列单位，由18SrDNA、5.8SrDNA、26SrDNA及位于三者之间的基因内转录间隔区(ITS)组成。18S、5.8S、26SrDNA的序列非常保守，可以用与它们序列互补的通用引物对ITS区进行PCR扩增、测序。被子植物的ITS区长度比较稳定，包括5.8SrDNA在内，总长度一般只有600-700bp。已广泛应用于植物系统学研究，其碱基序列同源性的程度决定生物之间的亲缘关系远近^[6-7]。

目前蒙古扁桃的品种鉴定仅限于传统形态学分析、显微结构分析、化学指纹图谱等，但是这些传统的鉴定方法都有其自身缺点。对于形状相似的旱生种，通过性状鉴定难以区分，而且植物形态易受地理环境、生长期等诸多因素的影响，从而影响鉴定的准确性；基于活性成分含量测定的化学分析方法容易受到其生理条件、贮藏等因素的影响，不利于品种的区分；同时HPLC、CE、MS等化学分析仪器设备价格昂贵，非一般实验室能够负担。依靠传统的形态分类学方法在蒙古扁桃的鉴别上存在着局限性。

发明内容

为了克服蒙古扁桃在形态学上鉴定的缺陷，本发明针对目前存在的蒙古扁桃濒危状态，将条形码技术应用于鉴别蒙古扁桃品种，通过扩增ITS序列并对其进行分析，从分子水平探讨它们之间的亲缘关系，进而提供一种鉴别蒙古扁桃品种的方法。

rDNA的ITS序列长度相对较短，对于样品DNA已部分降解的材料而言，ITS序列表现出较高的PCR扩增和测序效率。另外，ITS具备二级结构，为蒙古扁桃物种鉴别提供独特的分子形态特征。本发明运用ITS序列鉴别蒙古扁桃，操作简便、用量少、实用性强，可以快速、准确的鉴别开蒙古扁桃，适于广泛推广应用。

在一个方面，本发明提供一种用于鉴定样本是否属于蒙古扁桃的方法，所述方法包括以下步骤：(1)从所述样本中提取基因组总DNA；(2)以步骤(1)中提取的DNA为模板，使用用于扩增ITS序列的特异性引物对进行PCR扩增；(3)对PCR产物进行测序；(4)将测序结果与一种或多种已知蒙古扁桃物种的ITS序列进行序列比对；以及(5)根据序列比对结果鉴定样本是否属于蒙古扁桃。