[发明专利]基于NTA的IMAC填料及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种基于NTA的IMAC填料及其制备方法和应用。该制备方法包括如下步骤：提供一种基质；在所述基质的表面构建醛基，得到表面具有醛基的基质；将醛基转化为α‑氨基羧酸，得到表面具有α‑氨基羧酸的基质；在所述表面具有α‑氨基羧酸的基质的表面构建NTA基团，得到表面具有NTA基团的基质；以及将NTA基团与过渡金属离子螯合，得到基于NTA的IMAC填料。上述基于NTA的IMAC填料的制备方法，避免使用高成本原料，而且制备工艺清洁，纯化过程简单。

技术领域

本发明涉及填料技术领域，特别是涉及一种基于NTA的IMAC填料及其制备方法和应用。

背景技术

固定化金属亲和层析的概念最早由Porath等人在1975年提出，其原理是基于固定在固相载体上的过渡金属离子如Zn²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Co²⁺等与组氨酸残基、半胱氨酸残基的亲和作用来分离目的蛋白。在Porath等人的著作发表之后，IMAC技术被广泛用于各种蛋白质和多肽的纯化应用。至今，Porath等人研究的用于固定金属离子到固相载体上的螯合配体亚氨基二乙酸(IDA)仍然被很多IMAC商品所使用。在1987年，Hochuli等人发明了改进的金属螯合配体次氮基三乙酸(NTA)，伴随着现代分子生物学和重组蛋白技术的高速发展，基于NTA配体的IMAC在纯化组氨酸标签(His-tagged)蛋白方面得到了很重要的应用。此外，Porath等人还发明了三羧甲基乙二胺(TED)作为新型的金属螯合配体。

众所周知，广泛用于IMAC的金属离子为Ni²⁺，其周围共有六个配位点供配体结合。在上述三种金属螯合配体中，IDA是三齿配体，即可以结合Ni²⁺周围的三个配位点，剩余的三个配位点中两个用于结合组氨酸标签蛋白中的组氨酸残基，另一个用于和H₂O配位结合，因此，IDA对Ni²⁺的结合能力相对较弱，造成结合到介质上的Ni²⁺容易脱落，致使介质的性能不稳定。而NTA是四齿配体，即NTA可以结合Ni²⁺周围的四个配位点，剩余两个配位点用于结合组氨酸标签蛋白中的组氨酸残基。相对于IDA，NTA可以充分利用Ni²⁺周围的配位点，增强对Ni²⁺的螯合能力，但又不会影响Ni²⁺对组氨酸标签蛋白的结合能力。此外，TED为五齿配体，即TED可以结合Ni²⁺周围的五个配位点，只剩余一个配位点用于结合组氨酸标签蛋白中的组氨酸残基，导致Ni²⁺对组氨酸标签蛋白的结合能力下降，选择性减弱，因此在实际应用当中使用较少。

综上所述，NTA作为较理想的金属螯合配体，被广泛应用于IMAC技术进行组氨酸标签蛋白纯化。而制备基于NTA的IMAC填料的传统方法是通过N_α,N_α-双(羧甲基)-赖氨酸与微球基质偶联，螯合Ni²⁺的活性基团是NTA，而活性基团与微球之间的连接臂是氨基丁基基团。但这种方法最大的缺陷是N_α,N_α-双(羧甲基)-赖氨酸具有高昂的成本，严重阻碍基于NTA的IMAC填料的工业化应用。

发明内容

基于此，有必要针对制备基于NTA的IMAC填料的原料成本高昂的问题，提供一种基于NTA的IMAC填料及其制备方法和应用。

一种基于NTA的IMAC填料的制备方法，包括如下步骤：

提供一种基质；

在所述基质的表面构建醛基，得到表面具有醛基的基质；

将醛基转化为α-氨基羧酸，得到表面具有α-氨基羧酸的基质；

在所述表面具有α-氨基羧酸的基质的表面构建NTA基团，得到表面具有NTA基团的基质；以及