[发明专利]一种牡丹的基因组原位杂交方法及其应用

说明书

本发明涉及一种牡丹的基因组原位杂交方法及其应用。本发明提供一种牡丹的基因组原位杂交方法，其采用三步法对包含探针DNA和封阻DNA的杂交混合液以及待检测染色体进行变性处理，将变性后的杂交混合液和染色体杂交；所述三步法为分别将杂交混合液和染色体进行变性处理后，再将杂交混合液和染色体混合进行共变性处理。本发明通过对基因组原位杂交的条件参数进行全面的调整和优化，得到了高效的牡丹基因组原位杂交方法，其杂交成功率和特异性显著提高，杂交信号在染色体上具有更高的清晰度，能够准确区分来自于杂交双亲本的染色体，可以在实践中用于牡丹的种质鉴定及杂交育种的遗传分析。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种牡丹的基因组原位杂交方法及其应用。

背景技术

牡丹属于芍药科芍药属牡丹组，为中国的传统名花，栽培应用的历史悠久，具有较高的观赏及应用价值。经过1600多年的人工选育，牡丹形成了众多的优良品种。其中亚组间远缘杂交在品种培育过程中发挥了极其重要的作用，目前，美国牡丹芍药协会已登录的牡丹亚组间杂交品种有426个。但对于牡丹亚组间远缘杂交成功的机理、远缘杂种的遗传组成等研究还十分缺乏。对牡丹亚组间远缘杂交后代染色体的研究，有利于揭示杂种后代的杂交机理，为牡丹的远缘杂交育种提供一定的指导。

染色体的识别是染色体研究的基础工作。染色体的识别是指通过一定的标记将不同的染色体区分开，包括染色体组、单个染色体以及染色体片段，这一直是细胞遗传学研究的重要内容(Kato et al.，2005)。

压片法开启了染色体核型分析的开端且一直是核型分析的常用手段之一(Belling，1921)。传统的核型分析以染色体的基础测量数据如相对长度、着丝点位置及臂比值等为染色体识别的依据,在最初的研究中扮演了重要的角色。关于芍药属牡丹组植物的核型分析，已有前人做过大量的工作，涉及牡丹的所有野生种及栽培牡丹的多个品种，为该组植物细胞学研究奠定了理论基础，对确定野生种分类地位、演化关系及遗传育种工作等具有重要的价值。(Stebbins，1938；李懋学等，1982；王莲英等，1983；于兆英等，1987；张赞平等，1988；洪德元等，1988；龚洵等，1991)。传统的核型分析对于形态相近的染色体或区段变异的区分缺乏准确性，因此需要可以进一步显示染色体的内部结构的技术来进行染色体的准确识别。

染色体显带技术可通过一定技术显现染色体的纹路，进行染色体内部结构的识别，若染色体结构发生变异，带纹也可能发生变化，可用来区分各条染色体以及初步鉴定染色体的变异，是染色体识别从外部形态研究向内部结构研究的一个转折点(Casperson etal.，1968)。染色体显带技术包括C带、G带、银染法、N带、R带、T带等多种带型分析方法。另外，高分辨显带技术使染色体分带细、带纹可达800条甚至更多，染色体识别更为准确，在临床医学和植物染色体识别等方面皆有应用(Yunis，1976)。染色体显带技术在牡丹中也有一定的应用，C带及银染带等的分析结果可作为鉴别种及品种的依据(张赞平等，1990；于玲等，1997；裴彦龙，1993)。

对于一些染色体较小，浓缩程度高且形态相近的物种，染色体经显带技术处理后不能产生相应的带纹或产生的带纹有限，因此仍难以准确识别所有的染色体。染色体原位杂交技术(in situ hybridization)可通过探针与靶DNA的结合产生的荧光信号位点进行染色体的准确识别。该方法使用标记的核酸序列作为探针，与染色体上的靶DNA进行杂交，由于探针在不同染色体上组成、分布、位置和重复数的不同，可进行染色体的准确识别，应用较为广泛。