[发明专利]一种含WSB1基因启动子和报告基因的重组质粒及其构建方法和应用

说明书

本发明提供了一种含WSB1基因启动子和报告基因的重组质粒及其构建方法和应用。具体地，克隆WSB1基因启动子特异性序列，重组到含萤火虫荧光素酶报告基因载体序列中，构建含WSB1基因启动子和报告基因的重组质粒，再将构建的重组质粒与海肾荧光素酶报告基因质粒pRL‑TK共转染肿瘤细胞，使其稳定表达，最后通过检测双荧光素酶的活性来反映WSB1基因启动子启动转录的活性，从而应用于靶向筛选抗肿瘤药物。本发明构建的重组质粒采用的是WSB1基因启动子，并选取了特定的启动子序列，所构建的药物筛选模型具有高特异性、高灵敏度和高准确度，实现了以WSB1为靶点的抗肿瘤药物的高通量筛选。

技术领域

本发明属于基因重组和分子克隆技术领域，涉及一种肿瘤血管新生、侵袭转移相关基因靶点的重组质粒，具体涉及一种含WSB1基因启动子和萤火虫荧光素酶报告基因的重组质粒及其构建方法和应用。

背景技术

WD重复和SOCS盒结合蛋白1(WD repeat and SOCS box-containing protein 1，WSB1)是ECs泛素连接酶复合物的底物，包含7个WD蛋白复合体和一个SOCS盒，在骨肉瘤、神经母细胞瘤、胰腺癌、肝癌和唾腺肿瘤等许多肿瘤细胞中过表达。WD-重复蛋白(WD repeatProtein)是具有高度保守WD基元和功能各异的蛋白质，参与多种肿瘤细胞的调控过程，如细胞信号转导、RNA剪接、转录和囊泡运输等(Cell Mol Life Sci，2001,58(14):2085-2097)。SOCS盒是调节机体诸多细胞因子信号的重要调控分子，是蛋白泛素化和蛋白酶体降解过程的重要调节因子(Growth Factors，2012,30(4):207-219)，参与生物发育、免疫、肿瘤发生、代谢等许多生理调节过程。因此，WSB1是肿瘤细胞内重要的信号调节分子，参与细胞内蛋白泛素化和蛋白酶体降解过程，在肿瘤发生发展过程中发挥重要的作用，从发育生物学、细胞免疫、糖酵解、缺氧调节到泛素化功能，WSB1对肿瘤细胞增殖，侵袭，转移方面起到促进效应。

WSB1基因定位于人类基因组的第17号染色体的长臂(17q.11.1)，目前被文章报导的主要有三种不同的转录亚型，WSB1在最开始是被认为是一种细胞因子信号转导抑制物(SOCS box)和WSB2一起被发现的，随后的研究证实WSB1作为Hedgehog信号(通路)的一部分，调节雏鸡胚胎枝芽的生长，这个新发现的基因被命名为SWiP-1(SOCS box and WDrepeats in Protein 1)，随后的研究证实，雏鸡与人的WSB1蛋白序列相似性高达88％，小鼠与人WSB1蛋白序列相似性为96.29％。

WSB1的基本结构可以分为，N端的数个WD重复序列和C端的SOCS盒。WD基序最早于G蛋白的β亚基中被发现，也称为Trp-ASP或WD40，在真核生物的多种蛋白质中均有表达，但是在原核生物中很少发现有WD基序，WD基序含有大约40个保守氨基酸，大部分以GH(glycine-histidine)为N端，以WD(tryptophan-aspartic acid)为C端，其中tryptophan-asparticacid为核心序列，维持WD蛋白家族的高度保守性和稳定的空间结构。重复的WD序列通过相互之间的作用，形成β-折叠，作为与其他蛋白的结合位点，增强WD重复蛋白与其它蛋白质的相互作用。关于WSB1中所含的WD序列数量并不统一，目前发现有6～8个WD序列存在于WSB1蛋白中。