[发明专利]一种长效缓释细胞支架及其制备方法、应用

权利要求书

1.一种长效缓释细胞支架，其特征在于：包括药物-细胞因子蛋白、丝素蛋白和复合蛋白，所述药物-细胞因子蛋白经所述丝素蛋白混合包被形成细胞因子缓释微球，所述复合蛋白包被在所述细胞因子缓释微球的外层，所述丝素蛋白为通过钙盐调控自组装的丝素蛋白，所述复合蛋白是以明胶或者胶原为主的复合物；

所述复合蛋白包括不同浓度的I型胶原、II型胶原、III型胶原、明胶、硫酸软骨素、透明质酸、聚乳酸及其衍生物中一种以上；

所述药物-细胞因子蛋白包括浓度为0-2mg/mL的碱性成纤维bFGF、浓度为0-2mg/mL的转化生长因子β1、浓度为0-2mg/mL的转化生长因子β2、浓度为0-2mg/mL的转化生长因子β3和浓度为0-2mg/mL的BMP-2；

所述复合蛋白还加载所述药物-细胞因子蛋白。

2.根据权利要求1所述的长效缓释细胞支架，其特征在于：所述药物-细胞因子蛋白在经所述丝素蛋白包被后或经所述复合蛋白包被后，可再经交联处理或者不经交联处理，用于所述交联处理的交联剂包括但不限于TG酶、戊二醛中的一种或两种。

3.根据权利要求1所述的长效缓释细胞支架，其特征在于：所述丝素蛋白包括家蚕丝、柞蚕丝和野蚕丝中的一种或多种蚕丝经处理得到的再生丝素蛋白。

4.一种长效缓释细胞支架的制备方法，其特征在于：权利要求1-3任一一种所述长效缓释细胞支架通过下述方法制得，具体包括以下步骤：

S1：制备丝素蛋白混合溶液

将脱胶的蚕丝素纤维加入氯化钙/乙醇/水三元溶液中，所述蚕丝素纤维与所述氯化钙/乙醇/水三元溶液的浴比为1:5，氯化钙/乙醇/水三元溶液中三者的摩尔比为1:2:8，之后在70℃～74℃的条件下搅拌溶解1h，得到浓度为20mg/mL的丝素蛋白混合溶液备用；

S2：制备细胞因子缓释微球

将药物-细胞因子蛋白溶解于Tris-HCl缓冲液中制得药物-细胞因子蛋白混合液A，将步骤S1制得的浓度为20mg/mL的丝素蛋白混合溶液与浓度为4mM的葡萄糖酸钙溶液或浓度为4mM的CaCl₂溶液按照体积比为1:1的比例混合制得混合液B，将1mL混合液A加入到40ml混合液B中后置于37℃水浴环境中处理40min得到细胞因子缓释微球溶液，再将得到的细胞因子缓释微球溶液在12000r/min下离心处理10分钟后，取沉淀用去离子水反复洗涤除去未被包被的药物-细胞因子蛋白和葡萄糖酸钙或CaCl₂，再冷冻干燥并于4℃保存即得固体微粒状态的纳米级细胞因子缓释微球；

S3：在细胞因子缓释微球外包被复合蛋白

在步骤S2制得的细胞因子缓释微球外再包被一层可被细胞利用、具有软骨诱导作用的复合蛋白，所述复合蛋白是以明胶或者胶原为主的复合物；

S3.1：先取2.5g的明胶粉剂、0.5g的硫酸软骨素粉剂和25mg的透明质酸钠加入40mL双蒸水中于30℃条件下搅拌至完全溶解制得混合液C，之后用0.2μm针式滤器进行过滤除菌处理，得到复合蛋白溶液；

步骤S3.1中，将2ml浓度为10μg/ml的bFGF溶液加入40ml混合液C中后，再用0.2μm针式滤器进行过滤除菌处理，得到复合蛋白溶液；S3.2：将60mL的无菌植物油和1mL的Span80混合并预热至60℃，然后缓慢滴入预热至60℃的所述复合蛋白溶液，并采用电动搅拌机以500-900r/min的转速搅拌均匀，乳化时间10-15min，形成复合蛋白的稳定乳液；

S3.3：将步骤S2中制得的细胞因子缓释微球与制得的复合蛋白的稳定乳液按照混合比1:3v/v的比例混合，得到混合乳液；

S3.4：将步骤S3.3得到混合乳液冰浴冷却至5℃以下，此过程持续电动搅拌机以500-900r/min的转速搅拌，然后加入30mL预冷丙酮搅拌40min后电动搅拌机停止搅拌，再经高速离心机分离处理出微球后用蒸馏水反复清洗微球，最后将微球冻干处理，即完成明胶-硫酸软骨素–透明质酸钠包被药物-细胞因子蛋白的长效缓释细胞支架的制备。