[发明专利]一种肺泡Ⅱ型细胞的分离方法

说明书

本发明涉及肺细胞的分离技术领域，具体公开一种肺泡Ⅱ型细胞的分离方法，包括以下步骤：a、取出鼠肺组织，用灌注液灌洗；b、用缓冲液清洗肺泡腔，注入含有Ⅱ型胶原酶和弹性蛋白酶的消化液，消化15‑20min；c、将游离出来的肺叶剪成碎片，加入DNA酶Ⅰ和胎牛血清；d、加入洗涤液，洗涤、过滤得到细胞悬液；e、纯化肺泡Ⅱ型细胞；f、细胞培养基重悬肺泡Ⅱ型细胞。本发明分离得到的肺泡Ⅱ型细胞活性和纯度高，且分离得到的肺泡Ⅱ型细胞得率高。

技术领域

本发明涉及肺细胞的分离技术领域，尤其涉及一种肺泡Ⅱ型细胞的分离方法。

背景技术

由于空气污染和人类平均寿命的延长，呼吸系统疾病呈高发趋势，慢阻肺、肺癌等严重肺部疾病已成为国人健康的重大隐患之一。肺泡II型细胞作为哺乳动物肺泡上皮的主要组成部分，其不但有合成和分泌肺泡表面活性物质以维持肺表面张力、调节水盐平衡维持肺环境渗透压、合成免疫效应物分子抵御有害抗原物质对肺部的侵袭作用，还作为肺部的干细胞，具有修复急/慢性肺损伤、迁移并转化形成肺泡Ⅰ型细胞、维持肺部内稳态的重要功能，在受损肺上皮的修复中起着极其关键的作用。所以，肺泡Ⅱ型细胞的原代培养、肺泡Ⅱ型细胞向肺泡Ⅰ型细胞分化的机制及相关模型的研究，成为揭示肺部疾病的发病机理及探寻防治途径的基础，具有重要的理论和实际意义。

早在1974年，就有报道啮齿类动物肺泡Ⅱ型细胞的分离方法，然而，以往报道的实验方法中皆使用胰蛋白酶来消化肺组织块，低浓度的胰酶消化往往不能够让组织块充分解离，而高浓度胰酶消化对肺泡Ⅱ型细胞损伤很大，以至于最终所获得的肺泡Ⅱ型细胞要么是活率偏低，要么不容易贴壁。而且，由于肺部含有大量的毛细血管网，用胰酶消化所获得肺泡Ⅱ型细胞悬液中往往混有大量的肺泡巨噬细胞、白细胞，不利于对肺泡Ⅱ型细胞的进一步研究。

发明内容

针对现有分离肺泡Ⅱ型细胞过程中细胞间解离不充分、细胞损伤大以及获得的肺泡Ⅱ型细胞中含有其它细胞等问题，本发明提供一种肺泡Ⅱ型细胞的分离方法。

为达到上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：

一种肺泡Ⅱ型细胞的分离方法，包括以下步骤：

a、取出肺组织，用灌注液灌洗；

b、用缓冲液清洗肺泡腔，注入含有Ⅱ型胶原酶和弹性蛋白酶的消化液，消化15-20in；

c、将游离出来的肺叶剪成碎片，加入DNA酶Ⅰ和胎牛血清；

d、加入洗涤液，洗涤、过滤得到细胞悬液；

e、纯化肺泡Ⅱ型细胞；

f、细胞培养基重悬肺泡Ⅱ型细胞。

相对于现有技术，本发明提供的肺泡Ⅱ型细胞的分离培养方法，在对肺细胞分离过程中，使用特异性消化细胞间胶原蛋白的三维螺旋结构而对肺上皮细胞无损害的Ⅱ型胶原酶进行细胞间消化，降低对分离肺细胞的损伤，但Ⅱ型胶原酶的消化效率较低，为了保证细胞的消化效率同时又不损伤细胞，本发明通过加入弹性蛋白酶来辅助Ⅱ型胶原酶进行消化作用，弹性蛋白酶可以特异性消化细胞外间质中经过肽键结合、酰胺结合的和酯结合的蛋白质，弹性蛋白酶和Ⅱ型胶原酶的结合使用，使肺细胞的消化更充分，分离出的肺细胞活性和存活率较高，同时弹性蛋白酶和Ⅱ型胶原酶的结合使用可以大大减少分离出的肺细胞中巨噬细胞和白细胞的数量，提高肺泡Ⅱ型细胞的纯度。本发明还通过红细胞裂解液和免疫磁珠反向筛选法纯化肺泡Ⅱ型细胞，进一步提高肺泡Ⅱ型细胞的纯度，且不会损伤肺泡Ⅱ型细胞，最终得到高纯度和高活性的肺泡Ⅱ型细胞。

优选地，所述步骤a中的灌注液包括：PBS溶液、EDTA-2Na和EGTA，灌注液中EDTA-2Na和EGTA的浓度均为0.2mM，清洗肺组织中的组织液及游离的巨噬细胞。

优选地，所述步骤a中的灌洗过程为：将灌注液的pH值调节至7.2，37℃预热，灌注液通过气管灌洗肺泡腔6-10次。