[发明专利]一种器官芯片及基于器官芯片技术的纳米颗粒肺表面活性剂层相互作用评价方法

权利要求书

1.一种器官芯片，其特征在于：该器官芯片由四层构成，从上到下分别是第一、三层PDMS层（Ⅰ、Ⅲ），第二层亲水膜，第四层玻璃片（Ⅳ）粘合封接而成，在第一层PDMS层成型了包括细胞外基质入口通道(1)，纳米颗粒入口通道(2)，废液出口通道(3)，送气通道(4)，肺上皮细胞培养室(5)；第三层PDMS层（Ⅲ）设有抽气室(6) ，与第一层PDMS层（Ⅰ）上的抽气通道(7)相连通；其中，

所述的肺上皮细胞培养室(5)两端连接细胞外基质入口通道（1）、纳米颗粒入口通道（2）相交构成的Y型通道与废液出口通道（3），肺上皮细胞培养室(5)上表面与送气通道(4)相连。

2.按照权利要求1所述的器官芯片，其特征在于：所述的第二层亲水膜为PET膜（Ⅱ），可活动的设在第一层PDMS层（Ⅰ）的肺上皮细胞培养室（5）与第三层PDMS层（Ⅲ）的抽气室（6）之间，亲水膜（Ⅱ）的厚度为200-1000μm，肺上皮细胞培养室(5)的高度为100-1000μm。

3.一种基于器官芯片技术的纳米颗粒肺表面活性剂层相互作用评价方法，其特征在于采用上述芯片，按照如下步骤进行：

(1)芯片细胞接种及培养：

在培养基中培养人肺微血管内皮细胞，将肺上皮细胞制成悬液，将肺上皮细胞接种到肺上皮细胞培养室（5）中，并使其在静态条件下附着于亲水膜（Ⅱ）表面；然后通过注射泵向培养基灌注附着的细胞；

(2)加入纳米颗粒

待细胞表面完全附着肺表面活性剂蛋白质磷脂混合物后，在上部和下部通道中以20μl/ hr的体积流速加入不同大小、性质和材料的纳米颗粒；

(3)芯片细胞机械拉伸

使用自动化高精度打印机在预定位置沉积少量荧光纳米颗粒悬浮液，在PET膜上创建了微观荧光点阵列；在机械拉伸之前，一层的两个进气口打开，底部的抽气通道通过真空耐受管连接到计算机控制的真空泵，以循环方式同时对两个侧室施加真空来实现循环拉伸；

(4)芯片肺表面活性剂蛋白示踪

将放射性同位素标记的氨基酸(3H－亮氨酸)加到细胞培养液中供给细胞营养，在很短时间内使这些与未标记的相应氨基酸化学性质相同的标记分子进入细胞，除去培养液，用荧光显微镜观察；

(5)芯片细胞活性测试

使用细胞二丙酸脂荧光素分解酶进行活细胞活力的测定，二丙酸脂荧光素是非荧光性的亲脂性化合物，进入细胞活力较强的细胞内时，细胞内的活脂酶会将二丙酸脂荧光素的荧光分解，用荧光显微镜观察；

(6)芯片肺表面活性剂张力测试

使用疏水性脂族和芳族化合物的混合物测量表面张力，将20μL用结晶紫染色的DMP /O(4：1=v / v对苯二甲酸二甲酯/正辛醇)的液滴通过送气通道沉积在细胞单层表面上，并根据直径的比例估算下颌的表面张力，记录液滴沉积(d)和先前的沉积(d0)，对比由校准曲线得出表面张力的变化。

4.根据权利要求3所述基于器官芯片技术的纳米颗粒肺表面活性剂层相互作用评价方法，其特征在于所述的步骤(1)中芯片细胞接种及培养为，在补充有5％FBS和生长因子的EBM-2培养基中培养人肺微血管内皮细胞，接种前，通过UV照射对微流体装置进行灭菌，将肺上皮细胞制成悬液，将肺泡上皮细胞以约2×104个细胞/cm2接种到肺上皮细胞培养室中，并使其在静态条件下附着于膜表面3小时；然后通过注射泵以20μl/ hr的体积流速用培养基灌注附着的细胞，4小时后，停止培养基的流动，用显微镜观察肺表面活性剂的形成状况。

5.根据权利要求3所述基于器官芯片技术的纳米颗粒肺表面活性剂层相互作用评价方法，其特征在于所述的步骤(3)中模拟生理呼吸运动，微流体装置中的亲水PET层以0.2Hz的频率（正弦波形）以5~15％的应变拉伸。

6.按照权利要求3所述基于器官芯片技术的纳米颗粒肺表面活性剂层相互作用评价方法，其特征在于：芯片上的纳米颗粒与肺表面活性剂层相互作用模型添加肺表面活性剂中的蛋白质，实现对纳米颗粒对肺损伤的评价。