[发明专利]一种基于分子信标的ramp法快速检测方法

说明书

本发明属于生物医学临床分子检测领域，具体涉及一种应用于荧光PCR平台的基于分子信标的目的序列快速检测及其应用。其特征在于所述方法在反应终点利用分子信标检测产物，实现大幅缩短检测时间。近年来，核酸检测对于病原体的筛查有着非常重要的意义，其原因之一在于能快速获取结果。本发明将传统的荧光定量PCR时间缩短一倍以上，极大的缩短了检测时间，值得推广。

技术领域

本发明属于生物医学临床分子检测领域，具体涉及用于基于分子信标的目的基因快速检测方法。

背景技术

随着分子生物学的发展，分子诊断得到了广泛应用。分子诊断可以在基因层面进行检测，在检测灵敏度、准确性上有明显优势，更可以在病原体感染早期进行筛查，因而得到了广泛关注。目前，分子诊断技术主要可以分为核酸检测和生物芯片两大类。

核酸检测主要包括聚合酶链式反应、原位杂交和技术测序三大类，PCR技术因操作方便，通量高和成本低占据了分子诊断主流市场，其中包括了基于分子信标的检测技术。分子信标是利用荧光共振能量传递原理设计的一种发夹型寡聚核苷酸探针，它能够与待检测的目的序列相互作用改变结构从而产生不同强度的荧光信号。当温度大于分子信标退火温度时，分子信标呈自由扭曲状态，荧光基团大部分被淬灭，有较低的荧光背景；随着温度的降低，当体系中不存在待检测物时，分子信标由自由扭曲状态变成发夹型结构，背景荧光因能量共振传递而淬灭；当存在待检测物时，分子信标与目的片段结合，分子信标由自由扭曲状态成为线性结构，荧光基团不被淬灭，荧光大量增强。通过采集和分析荧光信号的变化，可以反应待检测物中的目的序列情况。

传统的荧光定量PCR（包括taqman，SYBR法和分子信标法等）通常检测约50-150bp的目的序列，虽然扩增的目的序列很短，但进行一轮检测（以50循环为例）往往需要2小时。其时间主要消耗在2个方面：1. 采集荧光。因荧光定量PCR每一轮扩增都要花时间采集荧光，如市场占有率最高的ABI 7300/7500系列，荧光采集通常在退火或延伸阶段，需要45秒，远高于一般的退火10-30秒或者延伸5-15秒的设定时间；2. 不同阶段的升降温过程。退火和延伸阶段温度与高温变性温度相差越大，所需的升降温时间就越长。传统的荧光定量PCR为了节约时间，往往采用二步法，即将退火和延伸合并为一步，设置温度为60度，时间为45秒并采集荧光，这样子虽然节约了采集荧光的时间，但与变性温度的巨大的温差，导致升降温过程漫长。因此，如果能大幅缩短上述两个过程的时间，荧光定量PCR（包括taqman，SYBR法和分子信标法等）的时间也可以被大幅缩短。

发明内容

本发明针对现有荧光定量PCR技术耗时长的问题，提供了一种基于分子信标的荧光PCR技术平台的快速检测方法，用于快速检测目的基因。本发明大幅缩短了检测时间，具有广泛推广价值。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

首先，进行目的产物的快速扩增。与传统方法不同的是，虽然反应体系中含有分子信标，但在扩增阶段不采集荧光信号，因此，整个程序时间被大幅缩短。

特别的，为进一步缩短该阶段时间，可以设计高退火温度引物，选择支持高温二步法的DNA聚合酶，如Thermo的phusion DNA聚合酶，可以将退火和延伸合并为一步，且温度设定在68度以上，同时延伸速度高达15秒/kb，因此，退火延伸阶段只需3秒时间。同时，温差的缩小，也使得升降温过程大幅度减少，即便是50轮的扩增循环也只需30多分钟（该时间随着不同仪器升降温速度不同略有差异）。

然后，用ramp法检测分子信标的荧光强度。具体而言，在PCR结束后，加上一段RAMP程序，即假设分子信标的退火温度值为T℃，则在（T+5）℃到（T-5）℃范围内步阶递减扫描检测荧光，通过比较荧光强度所构成曲线的线性，就可以判断待检测目的序列的状态。