[发明专利]利用CRISPR/Cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统改良水稻稻瘟病广谱抗性的方法

权利要求书

1.一种利用CRISPR/Cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统改良水稻稻瘟病广谱抗性的方法，以日本晴水稻品种为受体材料 ，其特征是利用CRISPR/Cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统通过农杆菌介导转化进行水稻Bsr-d1基因的启动子区域距离起始密码子-618位点的单碱基定点替换（A→G），获得转基因再生植株后鉴定筛选获得该位点的双等位突变植株，自交结实后筛选出转基因阴性后代，即为改良的具有稻瘟病广谱抗性水稻种质材料。

2.根据权利要求1所述一种利用CRISPR/Cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统改良水稻稻瘟病广谱抗性的方法，其特征是包括如下方法步骤：

（1）确定CRISPR/Cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统作用靶位点，

根据水稻品种日本晴的水稻Bsr-d1基因位点的启动子序列，确定水稻Bsr-d1基因的启动子区域目标突变位点(A)的下游邻近序列，在目标替换碱基下游设置2个不同的PAM1和PAM2，分别进行目标替换碱基的单碱基替换（A→G），其中PAM1的序列为ATAAGT，上游对应的包含目标替换碱基由20个碱基组成靶标序列为TTAAATTTTAACTGATAAAT；PAM2的序列为AGCG，上游对应的包含了目标替换碱基(A)由20个碱基组成靶标序列为AACTGATAAATATAAGTATA；

其中所述PAM1由CRISPR/Cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统ABE-P5系统识别，所述PAM2是由CRISPR/Cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统ABE-P4系统识别；

（2）构建CRISPR/Cas9介导的腺嘌呤碱基编辑载体，

按照（1）步的靶标片段的核酸排列顺序，构建用于水稻Bsr-d1基因的启动子区域目标突变位点(A)打靶的CRISPR/Cas9介导的腺嘌呤碱基编辑载体，所述CRISPR/Cas9介导的腺嘌呤碱基编辑载体包括具有所述靶标片段的向导RNA表达框以及Cas9核酸酶与tRNA腺苷脱氨酶TadA基因融合的表达框；

（3）遗传转化，

利用农杆菌介导转化法将已构建好的CRISPR/Cas9介导的腺嘌呤碱基编辑载体转入受体水稻品种日本晴，获得不少于200株独立转化植株；

（4）筛选并检测单碱基替换突变体植株，

CRISPR/Cas9介导的腺嘌呤碱基编辑载体转基因植株潮霉素阳性鉴定后，通过在单碱基替换靶位点侧翼引物扩增转基因植株，而后送样PCR产物和T载体克隆质粒进行测序，最后筛选并检测出完成单碱基替换突变体植株；

（5）筛选具有广谱稻瘟病抗性改良水稻，

选择步骤（4）已实现单碱基替换突变体植株即纯合突变T₀再生株系，种植结实收获T₁代种子，根据Cas9基因引物和潮霉素基因序列引物筛选出T₁代转基因阴性植株，为不携带任何转基因成分的具有广谱稻瘟病抗性改良水稻。

3.根据权利要求2所述的一种利用CRISPR/Cas9介导的腺嘌呤碱基编辑系统改良水稻稻瘟病广谱抗性的方法，其特征是步骤（2）所述构建CRISPR/Cas9介导的腺嘌呤碱基编辑载体，包括如下方法，

A）、在目标替换碱基下游找到合适的PAM位置，选择PAM上游的20个碱基作为靶标序列；

B）、根据20个碱基组成的靶标序列合成两条携带接头寡聚引物Oligo1和Oligo2；

C）、将B）步合成好的接头寡聚引物Oligo1和Oligo2分别溶解成80-120 μM母液，各取0.5-1.5μL加入到80-110 μL 0.5×TE混合稀释到1 μM；于温度为80-100℃，20-40 Sec ，移至室温冷却完成退火，为靶点接头引物 TAM；

D）、将C）步制备好的靶点接头引物 TAM 与经Bsa I酶切后回收的CRISPR/Cas9介导的腺嘌呤碱基编辑载体进行连接，连接程序为20-28℃ ，时间2-4h，12-20℃过夜连接；使用M13-F和靶点接头引物Oligo2于1-3%琼脂糖凝胶上进行PCR鉴定阳性克隆。