[发明专利]一种抗尿苷酸反馈抑制的氨甲酰磷酸合成酶突变体及其应用

说明书

本发明提供一种抗尿苷酸反馈抑制的氨甲酰磷酸合成酶突变体及其应用，所述突变体是在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的氨甲酰磷酸合成酶基础上，将第1006位的赖氨酸突变为丙氨酸得到突变体K1006A，或者将第1015位天冬酰胺突变为苯丙氨酸得到突变体N1015F。本发明的突变酶N1015F与K1006A较野生型Ec‑CarAB分别表现出解除抑制剂UMP的反馈抑制以及催化活性的提高。N1015F初始酶活较WT无变化，随着抑制剂UMP浓度的提高，其活性不变。K1006A其初始酶活较野生型提高了12％，随着UMP浓度的提高，其酶活逐步降低，并在20mM UMP浓度下达到饱和，相对酶活仍能够维持在65％以上。

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，尤其涉及一种抗尿苷酸(UMP)的氨甲酰磷酸合成酶突变体及其应用。

背景技术

氨甲酰磷酸合成酶(CPS)分为两种CPSⅠ和CPSⅡ，两者为同工酶，CPSⅠ是参与肝脏细胞能量代谢中尿素循环中的关键酶，可以去除细胞中多余的氨，此酶的缺失会导致高氨血症，CPSⅡ(EC 6.3.5.5)是嘧啶从头合成途径的第一个关键酶，以谷氨酰胺、碳酸氢盐、2Mg-ATP为底物，催化形成谷氨酸盐、磷酸盐和2Mg-ADP，反应生成的氨甲酰磷酸主要有两条代谢途径。一条是与天冬氨酸转氨甲酰酶耦合，参与嘧啶核苷的从头合成；另一条是与鸟氨酸氨甲酰基转移酶耦合，合成鸟氨酸。嘧啶核苷从头合成途径中，其过程中间产物UMP会反馈抑制氨甲酰磷酸合成酶的活性，从而影响嘧啶的生物合成。

来源E.coli的CPS是一个异质二聚体，包括催化谷氨酰胺水解为氨基的小亚基CarA(～42kDa)和催化氨甲酰磷酸合成的大亚基CarB(～118kDa)。大亚基CarB又分为四个功能域，即1-403为羧酸磷酸酯合成域、404-553为寡聚化结构域、554-936为氨甲酰磷酸合成域和937-1073为变构调节域。两亚基间存在运输氨并允许氨基甲酸酯在磷酸化中心之间的分子内迁移的通道(Acta Crystallographica,1999,55(1):8–24)。其中调节区是抑制剂UMP和激活剂IMP和鸟氨酸的结合位点，由五条平行β-折叠和五条α-螺旋组成，形成罗斯曼折叠(图1)。carB的1-553aa和554-1073aa之间存在高度的同源性，约40％，表明两部分具有类似的折叠结构，且均参与磷酸化反应，前半部分参与碳酸氢盐的磷酸化形成膦甲酸，后半部分参与氨基甲酸酯的磷酸化并形成氨甲酰磷酸(Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America,1983,80(15):4629-4633.,Journal of Biological Chemistry,1990,265(14):7742-7.,Biochemical SocietyTransactions,1993,21(1):198-202)。