[发明专利]一种交联酶聚体的制备方法

说明书

本发明公开了一种交联酶聚体的制备方法，所述为：将酶水溶液调节pH至2.5‑4.5，加入丙酮或乙醇，搅拌均匀后，室温静置1‑3h，排出酶水溶液与丙酮或乙醇总体积50‑70％的上清液后，在60‑100转/分钟搅拌下加入磷酸盐水溶液，继续搅拌20‑40分钟，室温静置1.5‑3.5小时，过滤，滤液与排出的上清液合并后蒸馏回收丙酮或乙醇；滤饼用去离子水洗涤，然后真空干燥，得到交联酶聚体；本发明方法制备得到的交联酶聚体酶活回收率达到94.3‑97.6％，比现有方法提高27‑36％；在45℃水中90分钟，酶活力保持率达到84.3‑88.7％，比游离酶酶活力保持率提高126.6‑158.6％。

(一)技术领域

本发明涉及一种交联酶聚体的制备方法，特别一种以磷酸盐为交联剂的交联酶聚体的制备方法。

(二)背景技术

2000年荷兰Delfe大学的Sheldondx提出一种酶的制剂新方法，在酶的水溶液中加入硫酸铵或乙醇沉淀酶蛋白，分离出酶蛋白后加入交联剂戊二醛水溶剂，制备得到酶聚集体。这种新型的酶制剂制备成本低，酶活稳定性高，耐热，耐有机溶剂，耐酸碱的性能均优于游离酶，可多次重复使用，成为开发的热点。近20年来，许多酶种均研制了酶聚集体，但是在制备中发现，以戊二醛作为交联剂，共价交联酶蛋白，制得的酶聚集体虽然机械强度较好，但戊二醛交联酶活力损失较大。一方面戊二醛分子尺寸小，可进入酶聚集体内部交联酶活性位点的基团，另一方面共价交联使酶聚集体比较紧密，阻碍部分酶活性位点。为此，国内外科技人员也探索了乙二醇双(N，N-羟基琥珀酰亚胺)作为交联剂，将琼脂，壳聚糖，葡聚糖，阿拉伯胶用高碘酸钾氧化，得到两个或多个交联基团，作为酶的交联剂，这些交联剂与酶蛋白的交联机理与戊二醛相似，只是分子尺寸变大，对酶活影响减少，但交联紧密依然影响酶活。采用磷酸盐作为酶蛋白交联剂，是磷酸根与酶蛋白的氨基、羟基之间的离子交联，磷酸盐分子尺寸较小，可以与酶聚集体内部的基团交联，形成的酶聚集体较稳定，仍保持聚集体的优点。而离子交联的强度明显低于共价交联，因而可较好的避免共价交联影响酶活性位点基团及交联紧密阻碍酶活的问题，使制备的酶聚集体活力保持更好。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种以磷酸盐为交联剂，以离子交联方式制备的交联酶聚集体，与国内外现有制备方法比较，可更好的保持酶催化活力，并具有酶聚集体的相应优点。磷酸盐作为交联剂的酶聚集体，用于食品加工，安全性有保障。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种交联酶聚体的制备方法，所述方法为：将酶水溶液调节pH至2.5-4.5，加入丙酮或乙醇，搅拌均匀后，室温静置1-3h，排出酶水溶液与丙酮或乙醇总体积50-70％的上清液后，在60-100转/分钟搅拌下加入磷酸盐水溶液，继续搅拌20-40分钟，室温静置1.5-3.5小时，过滤，滤液与排出的上清液合并后蒸馏回收丙酮或乙醇；滤饼用去离子水洗涤(优选3次)，然后真空干燥(优选在0.1大气压真空烘箱中45℃干燥3小时)，得到交联酶聚体；所述丙酮或乙醇体积用量以酶水溶液体积比为2-4:1；所述磷酸盐水溶液中磷酸盐与酶水溶液中酶的重量比为2～65：1。

进一步，所述酶水溶液浓度为1.0-20mg/mL，优选用0.5M磷酸调节酶液的pH至2.5-4.5。

进一步，所述乙醇优选体积浓度95％乙醇水溶液。

进一步，所述酶为脂肪酶或蛋白酶，更优选黑曲霉脂肪酶(深圳绿微康生物工程有限公司生产，30万单位/克)、假丝酵母脂肪酶(北京凯泰新世纪生物技术有限公司生产，13万单位/克)、中性蛋白酶(山东巨荣生物工程有限公司生产，5-20万单位/克，南宁东恒华道生物科技有限公司生产，20万单位/克)。