[发明专利]一种非侵入式检测患膀胱癌的概率的试剂盒

说明书

本发明公开一种非侵入式检测患膀胱癌的概率的试剂盒，包含标志物CK20和UCA1的基因的引物和探针。本发明可用于疑似膀胱癌的初步筛选及术后随访，减少膀胱镜检查频率，减少患者痛苦和风险，对填补国内膀胱癌体外分子诊断产品的空白有重要意义。

技术领域

本发明涉及检测试剂盒领域，具体涉及一种非侵入式检测患膀胱癌的概率的试剂盒。

背景技术

膀胱癌是指发生在膀胱黏膜上的泌尿系统最常见的恶性肿瘤，平均发病年龄约为65岁，其中约90％是移行细胞癌，其它10％主要为鳞癌和腺癌，其在2012年全国肿瘤登记地区膀胱癌的发病率为6.61/10万，列恶性肿瘤发病率的第9位。由于存在明显的预后差、易复发特征，且早发现、早治疗的膀胱癌患者5年存活率大于90％，因此早诊断对该病的治疗具有重要的意义。膀胱镜检查是目前诊断膀胱癌最可靠的方法，通过膀胱镜检查可以发现膀胱是否有肿瘤，但因其有创性且价格昂贵，病人依从性较差，且易刺激膀胱壁肿瘤，可能造成肿瘤的恶性膨胀和转移，不适合大规模筛查；尿脱落细胞学检查对尿路上皮癌诊断特异性高，但对分级低的膀胱癌敏感度低，易形成假阴性结果，且细胞的不典型或退行性变、泌尿系统感染、结石、膀胱灌注治疗及不同检查者间观察偏倚较大等因素也会对尿细胞学检查有影响。因此，无创简便、标本易获取的肿瘤标志物法在膀胱癌的早期诊断和术后检测方面的应用引起了更多研究者的关注。

目前市场上膀胱癌相关产品有膀胱癌细胞染色体及基因异常检测试剂盒(荧光原位杂交法)检测脱落细胞中3，7，17号染色体非整倍体以及P16(9p21)的缺失，以及相关肿瘤标志物产品如膀胱肿瘤相关抗原BTA定量测定试剂盒(微孔板化学发光法)、尿核基质蛋白22(NMP-22)检测试剂盒(胶体金法)等。其中尿脱落上皮细胞FISH技术较适用于尿路上皮癌术后复发的检测，但对低级别尿路上皮癌，缺乏与尿路上皮癌相关的遗传学异常会导致漏诊，易形成假阴性结果。NMP-22是参与维持细胞核功能的一种三维网状结构蛋白，可通过细胞凋亡而释放到尿液中，因而被认为与尿路上皮肿瘤密切相关，有研究表明其在膀胱癌上皮细胞内含量要比正常尿路上皮高数十倍。文献对NMP-22敏感度及特异性报道不一(47％～90％)，存在较大争议。膀胱肿瘤相关抗原(BTA)又称补体因子H相关蛋白，由尿路上皮肿瘤细胞和巨噬细胞产生，是膀胱肿瘤生长过程中释放进入膀胱的复合物，当尿液BTA水平较高时，提示尿路上皮肿瘤的发生，因此其可用于尿路上皮肿瘤的早期检测和复发监测。膀胱癌诊断治疗指南指出：BTA是较早用于检测膀胱癌的肿瘤标记物，多采用BTA Stat和BTATrak方法检测，其中BTA Stat是一种快速定性方法，根据相关文献报道敏感度和特异性分别为29％～74％和56％～86％；BTATrak是酶联免疫定量方法，敏感度和特异性分别为60％～83％和60％～79％，敏感度随着肿瘤分级和分期上升而提高。NMP-22及BTA检测无创、方便、快捷，但当出现血尿、尿路感染、泌尿系结石、前列腺增生等泌尿系统疾病，特别是行膀胱灌注化疗后，NMP-22及BTA检测假阳性率较高，因此高特异性及敏感度的膀胱癌肿瘤标志物仍亟待开发。

外泌体是细胞主动分泌的一类穿梭于细胞间，直径为30～150nm、密度为1.10～1.18g/ml的双分子层结构囊泡样小体，其可由不同类型细胞(包括肿瘤细胞)脱落释放，在大多数体液如外周血、尿液、唾液、腹水、羊水、乳汁、脑脊液、关节液、支气管肺泡灌洗液等中均可检测到。由于外泌体包含蛋白质、DNA、RNA等成分，能选择性的包裹/释放其细胞中的遗传信息，且现已有较多的文献报道外泌体内含物在细胞间通讯、肿瘤免疫及治疗等领域研究成果，因此提取细胞外的外泌体在疾病、肿瘤等方面的诊断、监控有巨大的应用潜能。目前国内关于外泌体的专利主要集中在外泌体的分离和检测层面，但尿液中提取外泌体应用于膀胱癌辅助诊断的公开报道较少，只浙江大学公布了一种尿液外泌体分离、富集及检测的集成检测方法及检测芯片，通过检测尿液外泌体中的癌症信息以期用于膀胱癌的无创诊断、监控，该方法利用外泌体跨膜蛋白CD63这一特有的标志物建立了一种芯片ELISA快速诊断方法，但并未进行膀胱癌特异性肿瘤标志物的筛选。

若能在提取的尿液样本外泌体中寻找并筛选出高特异性和敏感度的肿瘤标志物并借助分子手段进行快速检测，对于辅助膀胱癌的早期诊断和术后检测意义重大。