[发明专利]一种机械力对骨影响的研究方法

权利要求书

1.一种机械力对骨影响的研究方法，其特征在于：该方法由机械力抵御流失方法和机械力促进骨形成方法构成；其中

所述机械力抵御流失方法，包括以下步骤：

⑴配制酸性模拟体液：

按质量百分比称取0.7996 % NaCl，0.0350% NaHCO₃，0.0224% KCl，0.0228% K₂HPO₄･3H₂O，0.0305 % MgCl₂･6H₂O，0.0278% CaCl₂，0.0071 % Na₂SO₄，0.6057% (CH₂OH)₃CNH₂，并依次溶解于蒸馏水中，采用浓度为1M的HCl调节pH值至6.40，于115℃蒸汽灭菌20 min后置于冰箱冷藏室保存，使用前置于37℃水浴中20 min；

⑵制备离体骨样本：

将一小段打磨平整的新鲜骨块划上几道小口，置于0.5 M 乙二胺四乙酸二钠溶液中室温预处理24 h，即得离体骨样本；

⑶将所述离体骨样本固定在机械力装置内，并注入所述酸性模拟体液，然后施加机械力，在需要观测的时间点取骨块最上端部分，经干燥、灰烬化处理后进行X射线晶体衍射技术分析、谢乐公式计算磷灰石晶体的平均晶粒大小；

所述机械力促进骨形成方法，包括以下步骤：

①配制细胞营养液：

无菌条件下按体积百分比配制含20 %胎牛血清的α-MEM培养基，加入终浓度分别为100U/mL和100μg/mL的青霉素和硫酸链霉素，摇匀后置于冰箱冷藏室保存，使用前置于37℃水浴中20 min；

②制备成骨细胞样本：

将羟基磷灰石含量在10~20 %的多孔磷灰石-壳聚糖支架浸泡于75 %酒精中15分钟，放入培养皿中于无菌条件下自然晾干后备用；

按体积百分比1：9将体外培养的浓度为2~8×10⁷个细胞/mL的成骨细胞悬液与磷酸盐缓冲液配制的2 %低熔点琼脂糖于37℃混匀，倒入所述培养皿中淹没支架，于4℃放置20 min后剔除支架外多余的低熔点琼脂糖，并放入所述细胞营养液中，于37℃预培养24 h，即得成骨细胞样本；

③将所述成骨细胞样本固定在机械力装置内，并注入所述细胞营养液，然后施加机械力，在需要观测的时间点取出，用磷酸盐缓冲液将成骨细胞吹打、分散出来，提取mRNA、蛋白检测骨形成相关因子的表达水平。

2.如权利要求1所述的一种机械力对骨影响的研究方法，其特征在于：所述步骤⑶或所述步骤③中的机械力装置包括置于5% CO₂、37℃的培养箱中的步进电机（1）、底座（8）、透明的圆柱形容器（6）、支架（9）以及置于所述培养箱外面的与所述步进电机（1）依次相连接的电机控制器和可编程电源；所述支架（9）上分别设有所述步进电机（1）、活塞（3）和千分尺（5）；所述步进电机（1）通过金属杆连有椭圆形凸轮（2），该椭圆形凸轮（2）的底部设有所述活塞（3）；所述圆柱形容器（6）的上下面均为开口结构，其侧面上部设有圆形小孔；所述圆柱形容器（6）内设有固定于所述底座（8）上的基座（7），该基座（7）上固定有骨样本（10）；所述骨样本（10）上设有弹性垫片（4），该弹性垫片（4）与所述活塞（3）相接；所述电机控制器与计算机的USB接口相连，该计算机安装有与所述电机控制器配套的软件。

3.如权利要求2所述的一种机械力对骨影响的研究方法，其特征在于：所述支架（9）由不锈钢板、不锈钢杆和螺栓连接而成；所述不锈钢板设有圆形窗口，该圆形窗口设有上下移动的所述活塞（3）。

4.如权利要求2所述的一种机械力对骨影响的研究方法，其特征在于：所述活塞（3）上设有橡胶环。

5.如权利要求2所述的一种机械力对骨影响的研究方法，其特征在于：所述弹性垫片（4）为带有小孔洞的弹簧钢薄片。

6.如权利要求2所述的一种机械力对骨影响的研究方法，其特征在于：所述基座（7）设有固定所述骨样本（10）的卡槽。