[发明专利]一种胎盘间充质干细胞条件培养基的制备方法

说明书

本发明公开了一种胎盘间充质干细胞条件培养基的制备方法，其包括如下工艺步骤：1)培养P1代细胞；2)条件培养基制备：将细胞传代培养至P3代时，加入含有10％无菌过滤胎牛血清和1％双抗的DMEM培养基继续培养48h后收集细胞培养培上清液，继续收集P4～6代的细胞培养上清液，将收集的上清液用0.22μm滤器过滤后获得成品，控制总蛋白浓度为4μg/mL，4℃保存备用。本发明所制备的条件培养基含有许多生物活性物质，可促进细胞增殖和抑制凋亡，具有抗氧化和免疫调节作用，能显著提高衰老的人皮肤成纤维细胞的活力，具有延缓皮肤衰老、保持皮肤稳态的作用，在美容护肤产品的开发中具有强大的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种间充质干细胞条件培养基。

背景技术

衰老是机体生命活动发展的必经阶段，而皮肤衰老是机体衰老最外在的特征。研究表明，皮肤衰老是一个复杂的生理过程，是由多种机制综合作用的结果，可将其分为内源性老化和外源性老化。当机体随时间流逝逐渐步入衰老，细胞生长变得缓慢，活性下降，表现为皮肤弹性降低、松弛，出现细小皱纹；而生活环境中各种因素如空气污染、辐射、强紫外线照射等也会引起人体的皮肤损伤和老化。

随着生活水平的提高，人们越来越注重面部的保养，如何让自己抵御岁月的侵蚀，让肌肤继续充满光泽和弹性，延缓皮肤衰老的速度，是社会一直热切关注的问题。对此，许多爱美人士选择了各种针对皮肤衰老的手段，如单纯填充胶原蛋白、手术拉皮等，这些方法虽然能暂时改善外表上的不足，但对于真正恢复皮肤活力，从根本上延缓衰老不能起到很好的作用。据研究报道，皮肤真皮中最重要的细胞成分是成纤维细胞，其功能活性与皮肤状态密切相关。因此，延缓或抑制成纤维细胞衰老是治疗皮肤老化的重点。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是体内间质中存在的，为目前应用最广泛的成体干细胞。在适宜的微环境里，MSCs具有向血管、脂肪、神经、软骨、骨等多个胚层组织细胞分化的潜能，在组织修复与再生中发挥巨大的潜力。大量研究证实，多种MSCs具有表达、合成及分泌多种生物活性物质，调控周围细胞生长的旁分泌功能，其中的分泌因子如血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)等能促进成纤维细胞增殖，从而使皮肤厚度和胶原含量增加，对保持皮肤弹性，改善衰老现象有重要作用。

胎盘间充质干细胞(Placenta-derivedmesenchy-mal stem cells，PMSCs)是一种具有多项分化潜能的干细胞，其来源广泛，易于采集，对机体无损害作用，免疫原性低，在临床应用方面取得较大进展。研究发现，PMSCs有独特的免疫学特性和显著的增殖能力，可维持细胞活性，促进细胞分裂增殖，减少细胞凋亡，通过抗氧化和抗炎作用能有效延缓细胞衰老进程，而越来越多研究证明其作用是通过分泌的营养因子和细胞因子实现的。

发明内容

本发明的目的在于针对是上述现有技术的不足，提供一种胎盘间充质干细胞条件培养基的制备方法。

本发明所采取的技术方案是：一种胎盘间充质干细胞条件培养基的制备方法，其包括如下工艺步骤：

1)分离培养：采用剪切分离与胶原酶消化法从人胎盘组织中分离胎盘间充质干细胞，在胎儿间充质培养基中进行培养，当发现细胞集落生长，贴壁细胞融合至70～80％时用胰蛋白酶消化，进行传代，得P1代细胞；

2)条件培养基制备：继续用胎儿间充质培养基培养步骤1)所得P1代细胞并进行传代，将细胞传代培养至P3代时，待细胞生长至70～80％，弃去胎儿间充质培养基，用PBS溶液清洗一次，加入含有10％无菌过滤胎牛血清和1％双抗的DMEM培养基继续培养48h后收集细胞培养培上清液，继续收集P4～6代的细胞培养上清液，将收集的上清液用0.22μm滤器过滤后获得成品，控制总蛋白浓度为4μg/mL，4℃保存备用。

作为上述方案的进一步改进，步骤1)中所述的胰蛋白酶为0.25％胰蛋白酶。