[发明专利]一种与小麦抗低温、干旱、ABA及高盐相关的基因及其应用

权利要求书

1.一种与小麦抗低温、干旱、ABA及高盐相关的基因，其特征在于，所述基因具体为小麦5B染色体上的TaCOBL基因，所述TaCOBL基因的核苷酸序列具体为SEQ ID NO 1或SEQ ID NO2，当其核苷酸序列为SEQ ID NO 1时该序列命名为Hap5B-a；当其序列为SEQ ID NO 2时，该序列命名为Hap5B-b。

2.一种权利要求1所述基因在低温、干旱、ABA及高盐环境下表达模式的分析方法，其特征在于，该方法包含以下具体步骤：

步骤一：挑选籽粒饱满的小麦种子，用1/2Hoagland培养液进行水培至两叶一心期，选取1/5为对照株，4/5为胁迫株；

其中：对照株不进行任何胁迫处理

胁迫株分为四份并进行如下四种胁迫处理：

含有100μmol·L^-1ABA的Hoagland培养液处理；

含有20％PEG6000的Hoagland培养液处理；

含有100mmol·L^-1NaCl溶液的Hoagland培养液处理；

4℃光照下Hoagland培养液处理；

步骤二：分别剪取胁迫处理1、2、6、12和24h的胁迫株的叶片和根系，置于液氮中，用于胁迫过程中基因的表达特性分析；

步骤三：对步骤二获取的组织分别提取对应的RNA，然后分别进行反转录，以反转录的cDNA为模板，分别进行实时荧光定量PCR扩增，其中实时定量PCR扩增引物为：

F：ATAGGACCTTCACCTTCAGCC

R：CAGGAGCAGCACGAGCAA；

以小麦TaActin作为内参基因，引物为：

ActinF：ATGTACCGTGGTGATGTT

ActinR：CCTGGTGGCTGGTAGTTG。

步骤四：反应结束后根据循环阈值CT，用2^{-ΔC T}方法计算基因的相对表达量。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述实时定量荧光PCR扩增的20μl反应体系包括：10μmol/L的上游引物F 1μl、10μmol/L的下游引物R 1μl、THUNDERBIRD SYBR qPCRMix 10μl、模板cDNA 2.0μl、去离子水6μl。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述实时定量荧光PCR的反应程序为：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，36个循环，实验设置3次重复。

5.一种权利要求1中所述基因启动子活性的鉴定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤1、获取小麦DNA，利用以下引物对小麦DNA进行PCR扩增

5BF：5'ACGAAGCTTTTGCGGCCCTTGCATGTT 3'

5BR：5'ACGGGATCCCGTTGCACTCCCCTGCTAAT 3'

步骤2、取PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳检测并纯化回收目的基因；

将回收的目的基因与Pmd19-T simple vector连接，获得连接产物，验证后抽提目的质粒；

步骤3、以pCambia1391作为双元载体，构件含有目的质粒的启动子-GUS融合表达双元载体；

步骤4、将获得的启动子-GUS融合表达双元载体转入农杆菌EHA105，获得含有目标载体的农杆菌菌株；

步骤5、对4周龄烟草倒3-倒6叶叶下注射含有目标载体的农杆菌菌株，暗培养24h后进行低温处理；将注射后植株置入培养箱处理24h,在0h、1h、8h和24h分别取样，获得取样材料；

步骤6、定性检测：各取样材料通过GUS染色12h，乙醇梯度脱色后对GUS染色拍照；

步骤7、定量检测：各取样材料提取叶片总蛋白，通过荧光法测定GUS活性。