[发明专利]一种人脂肪干细胞原代培养及无血清多向诱导分化方法

权利要求书

1.一种人脂肪干细胞原代培养及无血清多向诱导分化方法，其特征在于：所述人脂肪干细胞原代培养及无血清多向诱导分化方法，采用胶原酶分离法获得皮下、网膜组织来源的人脂肪间充质干细胞，原代培养至80％融合，再进行传代培养，并进行脂肪间充质干细胞的鉴定。选用生长良好的第三代细胞，加入无血清诱导培养基进行诱导分化，最后进行油红O染色及茜素红染色鉴定成脂、成骨分化效果及Real-time RCR检测成脂、成骨基因表达情况。

2.如权利要求1所述的人脂肪干细胞原代培养及无血清多向诱导分化方法，其特征在于，所述人脂肪干细胞原代培养及无血清多向诱导分化方法包括以下步骤：

步骤一，采用胶原酶分离法获得皮下、网膜组织来源的人脂肪间充质干细胞，原代分离培养至80％融合，再进行传代培养；MTT法检测细胞细胞增殖情况，流式细胞仪鉴定细胞表面抗原；

步骤二，选用生长良好的P3细胞，诱导脂肪间充质干细胞分化为成脂细胞:先用A液诱导3天，然后B液诱导2天，交替循环3-5次后，用B液继续维持7天；

步骤三，选用生长良好的P3细胞，诱导脂肪间充质干细胞分化为成骨细胞:加入无血清成骨分化液诱导细胞，每3天换液一次；

步骤四，诱导后成脂、成骨细胞鉴定:形态学观察法、油红O染色法、茜素红染色法；

步骤五，通过Real-time RNA进行成脂、成骨相关基因的表达情况。

3.如权利要求2所述的人脂肪干细胞原代培养及无血清成脂诱导分化方法，其特征在于，我们同时进行了人皮下及网膜来源的人脂肪干细胞的原代培养，比较了其形态学和生理特征的差异。并进行多向诱导分化，诱导成脂分化的培养基由以下组分组成：成脂诱导分化液包括A液和B液；A液：包括无血清DMEM/F12培养液、100μmol/L抗坏血酸、1μmol/L地塞米松、200μmol/L吲哚美辛、10mg/L胰岛素、0.5mmol/L IBMX；B液：无血清DMEM/F12+10mg/L胰岛素；

A液：无血清DMEM/F12培养液中按浓度添加抗坏血酸、地塞米松、吲哚美辛、IBMX和胰岛素5ml，定容至500ml，经0.22μm针头滤器过滤除菌、分装，储存于4℃冰箱；B液：无血清DMEM/F12培养液中按所述浓度添加胰岛素5ml，定容至500ml，经0.22μm针头滤器过滤除菌、分装，储存于4℃冰箱。

4.如权利要求2所述的人脂肪干细胞原代培养及无血清成骨诱导分化方法，其特征在于，成骨诱导分化液包含：无血清DMEM/F12培养液、地塞米松0.1μmol/L、抗坏血酸或维生素C 50mg/L、β-甘油磷酸钠10mmol/L；配制如下：无血清DMEM/F12培养液按浓度添加抗坏血酸，β-甘油磷酸钠和地塞米松，定容至500ml，经0.22μm针头滤器过滤除菌、分装，储存于4℃冰箱。

5.如权利要求2所述的人脂肪干细胞原代培养及无血清多向诱导分化方法，其特征在于，配制对照组的含血清诱导培养基，即成脂诱导分化液包括A液和B液；A液：包括含10％血清的DMEM/F12培养液、100μmol/L抗坏血酸、1μmol/L地塞米松、200μmol/L吲哚美辛、10mg/L胰岛素、0.5mmol/L IBMX；B液：10％血清的DMEM/F12+10mg/L胰岛素；成骨诱导分化液包含，10％血清DMEM/F12培养液、地塞米松10-8mol/L、50mg/L抗坏血酸或维生素C 50mg/L、β-甘油磷酸钠10mmol/L。

6.如权利要求2所述的人脂肪干细胞原代培养方法，其特征在于，胶原酶消化液提前配制保存包括如下步骤：称取100mg I型胶原酶，1g牛血清白蛋白，充分溶解于50ml PBS缓冲液中，即配成2％I型胶原酶+2％BSA的消化液，消化液经0.22μm针头滤器过滤除菌，以5ml为单位，分装成小管，-20℃避光储存备用。