[发明专利]一种海洋红酵母来源的环氧化物水解酶及其应用

说明书

本发明公开了一种海洋红酵母来源的环氧化物水解酶及其应用，属于生物技术领域。本发明提供了一种来源于海洋红酵母R.paludigenum的环氧化物水解酶基因(rpeh1)及对应的氨基酸序列；构建了含有该基因的重组质粒pET28a(+)‑rpeh1和基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)‑rpeh1，并利用该菌株制备重组环氧化物水解酶；应用本发明构建的基因工程菌进行生物催化，制备得到对映纯的R型苯基乙二醇ee73％。

技术领域

本发明涉及一种海洋红酵母来源的环氧化物水解酶及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

手性环氧化物或邻二醇是一类高附加值的多功能合成子，可用于药物、精细化学品、农药和功能性材料等的合成。环氧化物水解酶(epoxide hydrolases，EHs)能催化外消旋环氧化物的水解动力学拆分或对映归一性水解，保留单一构型环氧化物或转化为手性邻二醇。目前报道了约40种对映选择性高的EHs(对映选择率E值30),主要用于环氧化物的水解动力学拆分，但理论产率仅为50％。

与水解拆分不同，对映归一性水解的理论产率可与水解拆分不同，对映归一性水解的理论产率可达100％。对映归一性水解制备手性邻二醇有三种途径:(1)对映和区域选择性高且互补的两种EHs联合催化。Lin等将源自Streptomyces globisporus和Streptomyces carzinostaticus的两种EHs共催化外消旋环氧苯乙烷(SO)归一性水解，(R)-苯乙二醇(PED)的产率和纯度分别为87％和99％e.e._p。(2)生物酶法和化学酸法串联催化.Orru等利用Nocardia sp.胞内对映和区域选择性高的EH攻击一种对映体中取代基少的β-碳原子，构型保留；再用硫酸催化残留的另一种对映体水解，攻击发生在取代基多的α-碳原子上，构型反转。(3)区域选择性高且互补的单一EH催化。Kotik等利用表达最优AnEH突变酶H∶12-A1的E.coli全细胞催化(R,S)-SO对映归一性水解，(R)-PED的纯度为70.1％e.e._p。

一些具有环氧化物水解酶活性的菌种，如鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)，红球菌(Rhodococcus sp.)，黑曲霉(Aspergillus niger)等先后被分离。Liu等将黑曲霉的环氧化物水解酶基因导入大肠杆菌中表达并获得成功，该酶以对硝基氧化苯乙烯为底物，酶活力达到104.5U/mg。Furstoss等发现A.niger(LCP 521)和Beauveria bassiana(ATCC7159)产生的酶有很高的立体选择性，并且酶的区域选择性相反。随着生物信息学的发展、基因序列信息的积累以及基因工程技术的进步，快速获得新的EH基因已成为可能，且来源于真菌A.niger和细菌Agrobacterium radiobacter ADI的EH分子的微观结构已通过x-射线分析，为EH的基因工程研究提供了条件。

发明内容

本发明的目的是提供一种海洋红酵母(Rhodosporidium paludigenum)来源的环氧化物水解酶、环氧化物水解酶工程菌的构建以及重组环氧化物水解酶的异源表达方法。本发明发现了来源于Rhodosporidium paludigenum的一种新型环氧化物水解酶，命名为RpEH1，其相应的基因命名为Rpeh1。RpEH1具有较高的催化活性和手性选择性，有较大的工业化生产和应用潜力及经济价值。

本发明的第一个目的是提供一种(Rhodosporidium paludigenum)来源的环氧化物水解酶，环氧化物水解酶是(a)、(b)或(c)：

(a)含有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有环氧化物水解酶活性的由(a)衍生的蛋白质；

(c)与(a)限定的氨基酸序列具有97％同源性且具有环氧化物水解酶活性的蛋白质。