[发明专利]一种哺乳动物早期胚胎冻存液及冻存方法

说明书

本发明公开了一种哺乳动物早期胚胎冻存液及冻存方法，所述的胚胎冻存液包括卵磷脂、乙二醇、聚蔗糖、蔗糖、甘油、聚乙二醇、牛血清白蛋白和EBSS缓冲液的混合配制而成。其中，渗透性冷冻保护液有卵磷脂、乙二醇和甘油；非渗透性冷冻保护液有聚蔗糖、蔗糖、聚乙二醇和牛血清白蛋白；利用EBSS缓冲液维持胚胎冻存液的稳定性。本发明通过改良冻存液配方降低冻存液毒性，同时提高溶液粘度，提高溶液渗透效率，通过改进冻存方法，提高冻存玻璃化速度，综上，可提高胚胎存活率以及解冻后发育率、着床率和产仔率。

技术领域

本发明涉及哺乳动物或转基因动物辅助生殖及保种领域，特别涉及一种哺乳动物早期胚胎冻存液及冻存方法。

背景技术

胚胎冻存，是哺乳动物或转基因动物辅助生殖及珍稀动物保种过程常用的技术手段。胚胎冻存分为短期保存和长期保存。短期保存是将胚胎放于0-4℃的低温环境下，在此条件下胚胎暂停发育，但只能存放2-3天，仅作为辅助生殖前或受精后暂存。长期保存是将胚胎贮存在-196℃的超低温环境中，该种保存方式大大提高了胚胎移植技术的可能，为长期保存珍稀哺乳动物、人类辅助生殖、转基因小鼠和种畜引种等方面提供了必要条件。然而，长期胚胎保存面临的最大问题是在冷冻保存过程中，胚胎细胞内出现冰晶，造成胚胎损伤。防止上述损伤的第一种解决办法是使用冷冻保护剂进行慢速程序冷冻法。该种冷冻保存方法最早成功于1972年,Whittingham等人首次对利用慢速程序冷冻法对小鼠的胚胎冷冻保存获得成功，并在解冻后移植产下了后代，其保存的胚胎80％具有继续发育的能力。这种方法经过30年的发展,效果已基本稳定,目前仍然在世界范围内广泛使用。然而，慢速程序冷冻法虽然大大缓解了细胞损伤，但仍然不能避免细胞内出现冰晶。因此，第二种解决办法即胚胎玻璃化冷冻出现。玻璃化是指某些高浓度溶液在快速降温过程中直接跳过冰晶形成，即不发生结晶形成一种无规则结构的稳定玻璃样固体，在该玻璃化结构中，胚胎细胞可免受冰晶损伤。上述两种方法经过多年发展均有较多应用。其中，全球最大的转基因小鼠研究中心美国杰克逊实验室便利用慢速程序冷冻法进行了超过两百万次胚胎冻存；但是，由于慢速程序冷冻法缺点较为明显，胚胎玻璃化冷冻更具有升级发展的潜力，现今人类的辅助生殖技术中，也大多应用胚胎玻璃化冷冻技术进行长期胚胎冻存。

目前，影响胚胎玻璃化冷冻的重要因素是玻璃化抗冻保护液的选择，玻璃化的重要一环就是胚胎处于一个高浓度抗冻保护液环境。冷冻保护剂根据其是否穿透细胞膜可分为渗透型和非渗透型两类。渗透型冷冻保护剂：可以渗透到细胞内，主要包括甘油、DMSO、丙二醇、乙酰胺、甲醇等；非渗透型冷冻保护剂：不能渗透到细胞内，主要包括蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖和白蛋白等。现有的解决方案多采用上述两种类型保护剂结合，但由于主要的渗透型抗冻保护均具有较大毒性，因此通过研发改良抗冻保护液配方，使其具有低毒性和强渗透率，成为提高胚胎冻存技术的关键。

发明内容

本发明目的在于提供一种哺乳动物早期胚胎冻存液及冻存方法，通过改良冻存液配方降低冻存液毒性，同时提高溶液粘度，提高溶液渗透效率，通过改进冻存方法，提高冻存玻璃化速度，综上，可提高胚胎存活率以及解冻后发育率、着床率和产仔率。

为了实现上述功能，本发明提供以下技术方案：

本发明提供一种哺乳动物早期胚胎冻存液，包括卵磷脂、乙二醇、聚蔗糖、蔗糖、甘油、聚乙二醇、牛血清白蛋白和EBSS缓冲液的混合物。

一种哺乳动物早期胚胎冻存液包括如下组分：